论文部分内容阅读
背景:头颈鳞状细胞癌（头颈鳞癌,head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC）是人类最常见的恶性肿瘤之一。头颈鳞癌的发生常常与吸烟、饮酒以及HPV感染等相关。近年来,尽管放疗、化疗、手术等治疗手段取得了一定的进展,然而头颈鳞癌的5年生存率仍旧维持在50-60%。由于头颈鳞癌常常伴随着效应T细胞的失能、免疫抑制性细胞的聚集以及抗原提呈功能的异常等,头颈鳞癌被定义为一种存在免疫抑制性状态的疾病。肿瘤免疫疗法旨在恢复患者自身免疫系统对肿瘤细胞杀伤作用。与传统治疗方法相比,肿瘤免疫疗法能产生持续的抗肿瘤效果,特别是靶向免疫检查点（immune checkpoint）为癌症的治疗带来了巨大的变革。2016年,FDA批准PD-1单抗用于头颈鳞癌的治疗开启了头颈鳞癌免疫治疗的新纪元。然而,PD-1在头颈鳞癌的应答率并不高,这促使我们寻找新的免疫检查点,拓宽靶向免疫治疗检查点的治疗策略。淋巴细胞活化基因-3（lymphocyte activation gene-3,LAG-3）被认为是新一代的免疫检查点之一。LAG-3在T细胞、B细胞、调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）等多种免疫细胞上表达。LAG-3通常在耗竭或失能的T细胞表面表达增高,通过抑制T细胞的增殖及细胞因子的分泌等,减弱T细胞免疫反应。LAG-3在Tregs细胞上表达,可以增强其免疫抑制功能。这些作用有利于肿瘤细胞逃避免疫系统的杀伤,因而LAG-3可能会成为新的免疫治疗靶点。然而,LAG-3在头颈鳞癌的研究中较少,这也促使我们探索LAG-3是否在头颈鳞癌中发挥作用。目的:探究LAG-3在人类头颈鳞癌标本中表达情况。分析LAG-3表达与原发性头颈鳞癌临床病理参数之间的关系。探索LAG-3与原发性头颈鳞癌患者预后（总体生存期）的关系。分析LAG-3与原发性头颈鳞癌中其他免疫分子的相关性。在免疫健全双基因敲除头颈鳞癌小鼠模型中,研究LAG-3在不同免疫细胞亚群中的表达情况。在头颈鳞癌小鼠模型中研究阻断LAG-3对小鼠荷瘤过程的影响,并分析相关的免疫调控机制。方法:利用免疫组织化学技术在人类头颈鳞癌组织芯片中检测LAG-3的表达情况,并分析LAG-3的表达与肿瘤大小、淋巴结转移、病理分级的相关性。分析LAG-3表达与患者性别、年龄、吸烟、饮酒以及人类乳头状瘤病毒（human papillomavirus,HPV）感染是否相关。利用Kaplan-Meier单因素生存分析（K-M分析）和Cox多因素生存分析明确LAG-3在原发性头颈鳞癌患者中与预后之间的关系。利用皮尔森相关性检验（Pearson correlation）和聚类分析（Hierarchical clustering analysis）评估LAG-3与其他免疫分子的相关性。诱导免疫健全双基因敲除头颈鳞癌小鼠模型成瘤,利用流式细胞术（flow cytometry,FC）检测野生型（wild type,WT）小鼠和荷瘤的头颈鳞癌小鼠模型中CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+Foxp3+Tregs、CD11b+Gr1+髓源性抑制细胞（myeloid derived suppressor cells,MDSCs）、CD11b+F4/80+肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages,TAMs）表面LAG-3的表达情况。利用LAG-3单克隆抗体阻断LAG-3,观察小鼠肿瘤生长情况,记录小鼠体重。利用流式细胞术检测小鼠肿瘤及免疫器官中CD4+T细胞、CD8+T细胞、Tregs、MDSCs和TAMs的比例变化。体外培养CD8+T细胞,检测其分泌IFN-γ的能力。利用细胞因子芯片以及western blot检测肿瘤及外周血中细胞因子的变化情况。结果:LAG-3主要表达在肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes,TILs）。在原发性头颈鳞癌组织标本（n=122）中,LAG-3的表达明显高于正常黏膜（p<0.001）。LAG-3的表达与病理分级、肿瘤大小以及淋巴结状态相关。在复发性头颈鳞癌、转移淋巴结以及术前诱导放疗的肿瘤标本中,LAG-3的表达高于原发性头颈肿瘤。K-M分析显示在未发生淋巴结转移（淋巴结状态阴性）的原发性头颈鳞癌病人中,LAG-3高表达的患者预后较差（p=0.0108）。Cox分析显示在淋巴结状态阴性的原发性头颈鳞癌病人,LAG-3能够作为独立的预后因子（p=0.014）。相关性分析发现LAG-3与CD8、Foxp3、CD11b、CD33、CD68、CD163呈正相关。与野生型小鼠相比,荷瘤的头颈鳞癌小鼠模型中LAG-3在CD4+T细胞、CD8+T细胞、Tregs表达增高。然而,在髓系来源的细胞（MDSCs和TAMs）上,LAG-3几乎不表达。在头颈鳞癌小鼠模型中,利用单克隆抗体阻断LAG-3能够抑制小鼠头颈部及舌部肿瘤的生长。进一步的流式分析发现阻断LAG-3可以增加CD8+T细胞的数量,增强CD8+T细胞分泌IFN-γ的能力,而对CD4+T细胞的数量几乎不影响。同时阻断LAG-3可以在部分免疫器官或肿瘤中降低Tregs、MDSCs和TAMs的数量。初步的机制探究发现MDSCs和TAMs群体的减少可能与CCL2和CXCL1水平降低有关。结论:我们发现LAG-3能够作为淋巴结状态阴性的原发性头颈鳞癌病人的独立预后因子。在头颈肿瘤小鼠模型中,阻断LAG-3能够抑制肿瘤的进展,增强头颈鳞癌的抗肿瘤免疫反应。这些结果表明LAG-3可能是头颈鳞癌免疫治疗的潜在靶点。