秋茄(Kandelia candel)响应水淹的蛋白质磷酸化和乙酰化修饰及分子生理调控机制

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水淹是影响植物生长发育的重要环境因子之一。全球气候的异常变化致使水淹发生频繁,导致农作物的严重减产,造成重大经济损失。红树植物秋茄(Kandelia candel(L.)Druce)是一种生长在江海口潮间带滩涂上的耐水淹型木本植物,每天都会经历潮汐海水淹没,是研究木本植物响应水淹机制的良好材料。为了探讨秋茄植物响应水淹的分子生理适应机制,以未水淹处理(Control)和水淹处理(Flooding)的秋茄幼苗为试验材料,首次应用磷酸化蛋白质组学技术和乙酰化蛋白质组学技术分别探索秋茄叶片响应水淹过程中蛋白质磷酸化修饰和乙酰化修饰水平的变化,并结合qPCR分析以及植物生理生化指标检测揭示秋茄适应水淹环境的分子生理机制。同时,对秋茄叶片中重要基因RCA进行克隆和表达分析以探讨该基因在水淹环境下的潜在作用。主要结果如下:(1)秋茄叶片的磷酸化蛋白质组的结果显示,总共鉴定到2603个磷酸化位点,2141个非冗余磷酸化肽段,以及1516个磷酸化蛋白质;发现了 10个保守的motif序列,其中有3个新的motif序列[GSP]、[G××SP]和[RS×S];在水淹处理下,共鉴定到96个差异磷酸化蛋白(磷酸化水平差异1.5倍以上,P<0.05),其中约3/4差异蛋白的磷酸化水平上调表达;综合GO功能注释、KEGG通路以及蛋白质功能分类分析,96个差异磷酸化蛋白主要参与丙酮酸代谢与能量形成、蛋白质合成代谢与修饰作用等生物学过程。另外,通过转录水平的分析,结果发现秋茄叶片在蛋白磷酸化修饰水平和转录水平协同调节响应水淹的生物学过程,其中包括呼吸作用和光合作用在内的丙酮酸代谢与能量形成过程。(2)秋茄叶片乙酰化蛋白质组的结果显示,总共鉴定到1041个赖氨酸乙酰化修饰位点,1021个乙酰化肽段,以及617个乙酰化蛋白质;发现了 6个保守的motif序列,其中有1个新的motif序列[K××××K],含有K、R和E氨基酸残基序列中的赖氨酸更容易被乙酰化修饰;在水淹处理下,总共鉴定到260个差异乙酰化蛋白质(乙酰化水平差异1.5倍以上),其中约3/5的差异蛋白质的乙酰化水平上调表达;经GO功能注释、KEGG通路分析以及蛋白质功能分类分析,68个显著差异的乙酰化蛋白质(乙酰化水平差异1.5倍以上且P<0.05)主要参与碳水化合物与能量代谢、光合作用的碳固定、胁迫响应与防御等生物学过程。此外,结合转录水平的分析发现,秋茄叶片响应水淹的碳水化合物代谢和光合作用过程受到蛋白质赖氨酸乙酰化修饰水平和转录水平的共同调节。(3)秋茄叶片生理生化试验的结果显示,在水淹处理下,秋茄叶片中POD和SOD的活性显著提高,AsA-GSH循环中抗氧化酶的活性和抗氧化剂的含量均明显提高,从而增强抗氧化能力;ATP含量略微下降,丙酮酸含量的显著增加,以及NAD+和乙酰辅酶A含量的显著减少;TCA循环中重要酶PDH、CS、ICDH、OGDH、MDH以及PEPC的活性显著下降或保持不变;糖酵解与无氧呼吸途径中关键酶PFK、GAPDH、PK、PDC以及ADH的活性均显著增强;PPP呼吸途径中关键酶G6PDH和6PGDH的活性明显提高;参与光合作用的关键酶Rubisco和RCA显著下降,光合速率明显降低(光合速率仍维持在79.3%水平),然而,叶绿素含量和PSII结构未受到显著影响;蔗糖含量增加,SPS以及SuSy活性显著增强。这些结果表明秋茄叶片通过提高POD和SOD活性以及AsA-GSH循环代谢,清除过多的ROS,缓解ROS伤害,通过转变有氧呼吸为有效的无氧呼吸、提高PPP呼吸能力、以及保持较高水平的光合作用,不断累积蔗糖,提供足够的碳源,从而为维持水淹下正常的生命活动提供足够的能量。这些代谢途径中大部分的关键酶都受到不同程度的磷酸化修饰或赖氨酸乙酰化修饰。(4)RCA基因的克隆和表达分析的结果发现,秋茄叶片RCA基因存在长链和短链两种类型,分别命名为KcRCAL(GenBank序列号:MG492021)和KcRCAs(GenBank 序列号:MG492022),KcRCAL的cDNA片段长度为1461 bp,编码440个氨基酸,推测成熟的KcRCAL蛋白质的相对分子量为42.49 kDa,属于β亚基(小亚基),而KcRCAs的cDNA片段长度为1425 bp,编码474个氨基酸,推测成熟的KcRCAs蛋白质的相对分子量为46.10 kDa,属于α亚基(大亚基);它们均存在磷酸化修饰位点和赖氨酸乙酰化修饰位点;氨基酸序列的系统进化树分析显示KcRCA与鹰嘴豆(Cicer arietinum)、榴莲(Durio zibethinus)的亲缘关系最近;浅水淹处理转基因植株的生理分析结果显示转KcRCAL和KcRCAs拟南芥幼苗的抗氧化能力得到提高,RCA和Rubisco活性的上升有助于增强水淹逆境下的光合作用;在水淹处理下,秋茄KcRCAL和KcRCAs的基因表达水平都明显提高,有利于秋茄幼苗抵御水淹胁迫。总之,秋茄幼苗可以通过维持足够水平的光合作用、完成有效的无氧呼吸以及提高PPP呼吸能力来保证稳定的能量供应。蛋白质磷酸化修饰和赖氨酸乙酰化修饰均可作为重要的调节机制,参与酶活性的调节以及光合作用、无氧呼吸和PPP呼吸途径等生物学过程的调控,从而使秋茄适应水淹环境。KcRCAL和KcRCAs基因的上调表达在秋茄响应水淹环境中发挥重要作用。转KcRCA基因的拟南芥可通过提高抗氧化能力和调节光合作用来抵御水淹胁迫。本研究将为完善植物的耐水淹机制提供新的试验依据,也为后续培育耐水淹品种提供新见解。
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