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辣椒无论在中国还是全世界均是一种重要的蔬菜和工业原料作物,其生产效益高。然而,辣椒也是土传病原菌多的典型茄科植物,病害的发生常常影响其产量和品质最终导致其效益下降。培育和推广应用抗病的辣椒品种是解决其生产中病害问题的最经济有效对策,而阐明抗病分子机制则是开展辣椒有效遗传改良的重要基础。鉴于植物抗病在很大程度上受到转录水平的调节,而WRKY转录因子在植物抗病中起重要调节作用,开展WRKY在辣椒等茄科植物抗病中的作用及机制研究是阐明抗病机制的重要途径。鉴于此,本研究开展了一个lle WRKY转录因子成员在辣椒抗青枯病中的作用,并分析了其作用机制,主要研究结果如下:1、通过全基因组WRKY基因启动子上顺式作用元件的扫描分析,发现一个WRKY家族成员启动子中含有应答病原菌的顺式作用元件,其推导氨基酸序列中含有保守的WRKY结构域,在其C端含有（C-X5-C-X23-H-X1-H）锌指基序,且发现该基因的推导氨基酸序列在野生种潘那利番茄、马铃薯、美花烟草和二倍体棉花等植物的所有WRKY家族成员中,分别与SpWRKY22、StWRKY22、NsWRKY22和GrWRKY22拥有最高的同源性,分别为91%、91%、88%和55%的相同氨基酸序列。因此,将其命名为CaWRKY22。2、鉴于基因表达产物的功能与其亚细胞定位密切相关,我们进一步分析了CaWRKY22的亚细胞定位,通过农杆菌介导的CaWRKY22-GFP（以GFP为对照）在本生烟草叶片上的瞬间表达,发现CaWRKY22-GFP均定位在细胞核中,而对照中的GFP则信号则分布在整个细胞。此外,我们还通过荧光定量RT-PCR分析了CaWRKY22在接种青枯菌或高温高湿逆境处理下的表达,结果表明CaWRKY22受青枯菌接种诱导而上调。鉴于SA,JA,ET和ABA在植物应答生物和非生物逆境中充当重要的信号分子,为了分析这些激素是否参与CaWRKY22表达的调控,我们通过荧光定量RT-PCR分析了 CaWRKY22在外源SA,MeJA,ETH和ABA作用下的表达,结果发现,外源SA,MeJA,ETH均可上调CaWRKY22的转录表达,而外源ABA处理却降低CaWRKY22的转录表达。这些结果暗示CaWKRY22可能参与辣椒应答青枯菌接种的调节,且受到SA,JA和ET等信号通路的协同正调节,而受到ABA信号通路的负调节。3、为了分析CaWRKY22在辣椒免疫中的可能作用,我们通过病毒诱导CaWRKY22沉默对辣椒植株接种青枯菌的影响,通过实时RT-PCR测定基因沉默的效力,结果表明,在TRV2::CaWRKY22辣椒植株中Ca WRKY22的转录水平仅为对照TRV2::00植株10%左右。TRV2::CaWRKY22辣椒植株在青枯菌接种后第7天表现出明显的枯萎表型,而TRV2::00对照辣椒植株的枯萎表型不明显。在青枯菌接种后72 h检测菌落形成单位（cfu）以分析辣椒植株中青枯菌的生长情况,发现TRV2::CaWRKY22植株cfu明显高于对照T-RV2::00植株,这些结果表明CaWRKY22沉默可导致辣椒植株降低对青枯菌接种的抗性。此外,我们还发现青枯菌接种的TRV2::CaWRKY22植株HR细胞坏死和H202的积累明显弱于对照植株,青枯菌接种24 h后对照叶片检测到较深的台盼兰染和DAB染色和较高的叶片离子渗漏,而在TRV2::CaWRKY22植株叶中,DAB和台盼蓝染色的强度以及叶片离子渗漏的程度均明显降低。通过qRT-PCR分析,发现CaWRKY22沉默可导致青枯菌接种下辣椒植株中CaPO2,CaPR4,C CaBPR1,CaDEF1和CaHIR1等抗病相关基因表达的下调。4、通过农杆菌介导的CaWRKY22瞬间表达（以空载体为对照）,发现CaWRKY22在辣椒植株中的瞬间表达可激活辣椒叶片产生明显的细胞坏死和H202的积累,表现出接种位点周围较深的台盼兰和DAB染色和较高的离子渗漏。通过qRT-PCR 分析,发现 CaWRKY22 瞬间表达可使 CaPO2,CaPR4,CaACS1,CaBPR1,CaDEF1和Cahir1等抗病相关基因表达的上调。5、染色质免疫沉淀（ChIP）分析发现,CaWRKY22可直接与CaPR1,CaDEF1,Ca WRKY40的启动子中含W盒的片段结合,而与不含W盒的片段不能结合,表明CaWRKY22可能通过与这些基因启动子上W盒结合,直接转录调节这些基因的表达。6、鉴于CaWRKY40在辣椒抗青枯病中也起正调节作用,我们进一步通过瞬间超表达结合qRT-PCR,分析了 CaWRKY22和CaWRKY40之间在表达上的相互关联。结果发现,CaWRKY22的瞬间超表达可激活CaWRKYK40的转录表达,而CaWRKY40的瞬间超表达也可激活CaWRKY22的表达;在TRV::CaWRKY22辣椒植株中CaWRKY40的转录表达水平显著低于对照的植株;在TRV::CaWRKY22辣椒植株进行 CaWRKY40 瞬间超表达,CaWRKY40 对 CaP02,CaPR4,CaACC,CaBPR1,CaDEF1和CaHIR1的转录水平的上调作用相对于对照得到消弱。7、我们进一步通过瞬间超表达结合qRT-PCR分析了 CaWRKY22与CaWRKY6、CaWRKY27和CaWRKY58的可能关联。结果发现,在农杆菌接种后24h,CaWRKY6,CaWRKY27和CaWRKY40瞬间超表达可促进CaWRKY22的转录表达,但CaWRKY58的瞬间超表达则降低CaWRKY22的转录水平。另一方面,CaWRKY22的瞬间超表达可提高CaWRKY6,CaWRKY27和CaWRKY40的转录水平,但却使CaWRKY58的转录水平降低。以上结果表明,CaWRKY22在青枯菌侵染的辣椒中诱导表达,从而通过转录调节包括CaWRKY40在内的一系列抗病相关基因的表达,增强辣椒植株的抗病作用。CaWRKY22 可与 CaWRKY6,CaWRKY27、CaWRKY40 构成正反馈环,与CaWRKY58构成负反馈环,共同构成WRKY网络,可能通过对大量抗病相关基因转录水平的精细调节,在辣椒抗青枯病中起十分重要的作用。然而,该网络的其它WRKY成员及网络成员之间的层次分布,它们在表达和功能上关联等还有待进一步研究。