研究背景和目的药物性肝损伤是指药物本身(中药、西药)或其活性代谢产物所导致肝功能不全甚至发展至肝功能衰竭，严重可致患者死亡[1]。有证据表明，非甾体类抗炎药是药物性肝损伤常见的原因[2]。在西方国家，统计显示非甾体类抗炎药被大量使用和构成了药物性肝损伤的常见原因[3]。事实上，全部药物性肝损伤约10%与非甾体类抗炎药有关[4]。在中国，非甾体类抗炎药占药物性肝损伤的比例是7.6%[4]；在美国，非甾体抗炎药是美国药物性肝损伤的最重要的原因，约占所有病例的41%[5]。对乙酰氨基酚是一类重要的非甾体类抗炎药，是药物性肝损伤和急性肝功能衰竭的最常见原因，尤其是在美国、西欧[6]，占成人急性肝功能衰竭的病例的一半[7]。对乙酰氨基酚是典型的剂量依赖性肝毒性药物，在体内经氧化反应形成高活性的中间代谢产物N－乙酰－对－苯醌亚胺（NAPQI）[8]。在治疗剂量时，对乙酰氨基酚在肝脏代谢主要是生物转化的第二相反应即与硫酸盐和葡萄糖醛酸结合，但有一小部分代谢药物通过生物转化的第一相反应即肝内质网中的细胞色素P450(CYP)介导的氧化反应，随后再进行第二相结合反应[8]。在生理状态下，氧化反应主要通过细胞色素P450酶系统，主要是CYP2E1和CYP3A4两种同功酶，形成大量的NAPQI，NAPQI与谷胱甘肽结合无毒的硫醇尿酸而排出[8]。当对乙酰氨基酚过量时，硫酸盐化作用和糖脂化作用的通路饱和，快速生成的NAPQI可导致肝内的谷胱甘肽（GSH）储备耗竭和降低解毒作用[9]。实验证明：长时间的禁食和慢性饮酒通过降低肝内谷胱甘肽储备和增加由酒精诱导CYP2E1酶的表达来增加对对乙酰氨基酚肝毒性的敏感性[10]。NAPQI耗尽肝内的GSH，使氧化系统和抗氧化系统失衡，生成大量活性氧族（ROS）和活性氮族（RNS）并产生氧化应激，最终导致肝小叶中心的坏死[11]。研究证明ROS和RNS在对乙酰氨基酚所致肝损伤中起着至关紧要的作用，许多抗氧化剂如谷胱甘肽[12]、五味子素[13]、维生素E[14]、胡萝卜素[15]、褪黑素[16]等已经被证明对对乙酰氨基酚所致的肝损伤具有保护作用。氢气是世界上已知的密度最小的气体，作为一种新型抗氧化剂，自2007年被日本学者Ohsawa等[17]人证明：吸入浓度为2%氢气能明显抑制大鼠脑部的局部缺血再灌注损伤或炎症损伤是通过选择性地降低了羟自由基、细胞毒性的活性氧自由基，从而有效保护细胞，提示氢气作为一种抗氧化剂在预防和治疗的应用潜力。许多报告已经证明了氢气不仅在脑部缺血再灌注损伤或炎症损伤有保护作用[17]，而且在心[18]、肝[19]、肾[20]等缺血再灌注的损伤中同样具有治疗作用。氢气在高压（0.4MPa）溶于生理盐水中制成的浓度大于0.6mmol/L氢生理盐水，更加安全、方便，研究同样证明氢生理盐水具有和氢气一样功能，对缺血再灌注损伤或炎症引起的损伤具有保护作用[21-25]。因此，本研究的目的是评估氢生理盐水在对乙酰氨基酚诱导肝损伤的保护作用，通过检测血浆ALT、AST和ALP水平，氧化应激、炎症反应相关指标及肝组织病理学。研究内容和方法一、对乙酰氨基酚所致小鼠肝损伤模型建立及实验分组1.对乙酰氨基酚所致小鼠肝损伤模型建立动物全部购自第二军医大学实验动物中心，并饲养一周，实验前动物被前禁食12小时。将配制2.5%的对乙酰氨基酚溶液，按照500mg/kg一次性腹腔注射，制备成急性肝损伤模型。2.实验分组将40只雄性BALB/C小鼠随机分成4组即：生理盐水组（NS组）、对乙酰氨基酚组（APAP组）、对乙酰氨基酚+生理盐水组（APAP+NS组）、对乙酰氨基酚+氢生理盐水组（APAP+HS组）。APAP组和NS组给予2.5%对乙酰氨基酚500mg/kg或等剂量的生理盐水一次性腹腔注射。而APAP+NS组和APAP+HS组除给予2.5%对乙酰氨基酚500mg/kg一次性腹腔注射后，每隔3小时再给予6ml/kg生理盐水或等剂量氢生理盐水腹腔注射。二、对乙酰氨基酚所致小鼠肝损伤实验研究的检测指标1.检测小鼠血浆的肝功能指标，如ALT、AST和ALP。2.检测小鼠氧化应激指标，如MPO、MDA、GSH。3.检测小鼠炎症因子，如IL-6、TNF-。4.观察小鼠病理组织学改变。三、氢生理盐水减轻对乙酰氨基酚所致小鼠肝损伤的可能机制1.氢生理盐水降低小鼠血浆ALT、AST和ALP水平可能与氢生理盐水能减少肝细胞坏死程度，稳定细胞膜的通透性，从而减少ALT、AST和ALP从坏死或损伤的肝细胞漏至血液中。2.氢生理盐水抑制MPO、MDA的生成，增加GSH的含量可能与氢生理盐水具有清除ROS和RNS，减轻ROS和RNS对线粒体的损伤，维持线粒体正常结构与功能，降低脂质过氧化反应和抑制氧化应激，保护肝细胞免受氧化应激及脂质过氧化反应的损害。3.研究表明细胞因子TNF-和IL-6参与APAP引起的肝脏毒性，而氢生理盐水显著降低血浆TNF-和IL-6水平和肝组织TNF-和IL-6基因表达，证明了氢生理盐水能够抑制对乙酰氨基酚所致肝脏炎症反应，避免吞噬细胞浸润并分泌大量炎症细胞因子，从而保护肝脏免受对乙酰氨基酚所致肝损伤。4.从HE染色光子显微镜观察证实：对乙酰氨基酚所致肝细胞坏死主要是急性肝小叶中央区大片坏死为主，肝细胞坏死程剂量依赖性，随着注射剂量的增加可能发展到肝功能衰竭甚至引起小鼠死亡。氢生理盐水治疗后，不仅明显改善肝脏外形、质地、颜色等，光学显微镜镜下观察提示：肝脏充血肿胀减轻，肝细胞索走向较清晰，肝细胞坏死面积显著减少，肝细胞保持一个较好的形态。结果一、HS降低对乙酰氨基酚所致肝损伤小鼠的血浆ALT、AST和ALP水平。二、HS抑制对乙酰氨基酚所致肝损伤小鼠的氧化应激。三、HS抑制对乙酰氨基酚所致肝损伤小鼠的炎症反应。四、HS降低对乙酰氨基酚所致肝损伤小鼠肝细胞坏死程度。结论实验以对乙酰氨基酚所致肝损伤小鼠为研究对象，通过研究证明：腹腔注射氢生理盐水能降低对乙酰氨基酚所致肝损伤小鼠的血浆ALT、AST和ALP水平，显著抑制氧化应激，抑制炎症反应，有效减轻肝细胞坏死的严重程度。