幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是革兰氏阴性、螺杆状的微需氧菌,可定植于胃粘膜上皮细胞,是慢性胃炎、消化道溃疡、胃粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤及胃癌发生的危险因素,1994年世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)已将其列为Ⅰ类致癌因子。幽门螺杆菌的某些菌株包含有一段由27-33个基因编码的35-40kb cag致病岛(PAI). cagA基因是cag致病岛的重要组成部分之一,它编码了幽门螺杆菌的重要毒力蛋白CagA (120-140kDa)。CagA蛋白含有一段能够发生酪氨酸磷酸化的EPIYA基序,幽门螺杆菌黏附到胃粘膜上皮细胞以后,可通过四型分泌系统将毒力因子CagA蛋白注入上皮细胞。在cagA-positive幽门螺杆菌菌株的感染中,细菌源性的致癌因子CagA蛋白广泛的参与到细菌感染导致的胃组织损伤以及致癌的过程之中,但涉及的分子机制尚未完全明了。肿瘤发生的标志之一是细胞进入无序增殖状态,伴有一些参与到调节细胞周期进程、细胞的增殖、分化以及凋亡、衰老的重要细胞因子的表达紊乱。新鉴定的重要原癌蛋白CIP2A能通过抑制PP2A的活性来稳定MYC蛋白的表达并且促进肿瘤的形成。并且,在胃癌组织中CIP2A的表达量高于相对应的正常胃组织,其功能与胃癌细胞的增殖能力密切相关。而作为Btk酪氨酸激酶家族成员之一的BMX/Etk激酶的功能也涉及到对细胞增殖能力的促进以及对环境刺激的适应性调控。因此,阐明幽门螺杆菌感染和CIP2A之间的效应关系可以帮助我们更深入的理解幽门螺杆菌感染的致癌机理以及CIP2A在胃癌发生发展中的重要作用。胃癌的发生发展除了受到幽门螺杆菌的菌株特点影响外,还受到宿主的遗传易感性和环境因素的影响,与胃癌高发风险相关的环境因素之一就是高盐饮食。在人群的流行病学研究和动物模型中高盐饮食和胃癌的发病率之间的关系已经被充分证实。但是高盐饮食是通过何种机制增强了人群中胃癌的发病率尚未完全明了。因此,探讨高盐对细菌诱导的CIP2A表达增强效应可以帮助我们更深入的理解高盐饮食和幽门螺杆菌感染在胃癌发生发展过程中发挥协同作用的分子机制。而表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)作为从天然植物绿茶中提取出来的单体成分(多酚类),其抑制肿瘤细胞增殖的能力已经通过动物实验模型、流行病学调查、以及病例对照研究等得到充分的证实。但EGCG抑制肿瘤发生发展的分子机制尚未完全阐明。因此,研究EGCG对细胞中CIP2A表达水平的影响可以为理解EGCG抑制肿瘤细胞增殖能力的分子机制提供更多的帮助。胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,中国是胃癌的高发国家,其致死率位居全球肿瘤相关致死率第二位。由于缺乏可靠的早期诊断标志,胃癌的预后情况并不乐观。促进胃癌发生发展的因素涉及生物致癌因素(幽门螺杆菌)和化学致癌因素(高盐和亚硝酸盐)的刺激；抑制胃癌发生发展的因素涉及多酚类(绿茶)和维生素类的摄入。肿瘤的分子诊断与预测,已成为近年来肿瘤研究的热点领域。而与胃癌发生发展相关的保护性和致癌性的因素是否都存在一个相同的作用靶点分子,至今尚未完全阐明。本研究的内容主要涉及幽门螺杆菌的感染以及环境因素中的高盐和EGCG的刺激对肿瘤细胞的增殖相关蛋白CIP2A表达的影响,旨在阐明CIP2A分子作为与胃癌发生发展相关的保护性和致癌性因素存在的共同作用靶点的依据。该课题主要研究内容及实验结果如下：一、幽门螺杆菌的感染能够促进CIP2A的表达上调幽门螺杆菌感染胃粘膜上皮细胞后,能激活一系列的信号途径,包括MEK／ERK途径,β-catenin途径,Src kinase途径,NF-κB途径,以及p38 MAP kinase途径。并且能够影响细胞内许多致癌因子的表达变化,例如影响MYC蛋白的稳定,影响β-catenin的核转移,以及影响细胞周期相关蛋白Cyclin Dl的表达。但是迄今为止,幽门螺杆菌的感染对原癌蛋白CIP2A表达的影响尚未明了。本研究通过实施幽门螺杆菌感染细胞以及CagA的表达质粒转染细胞的实验,以及应用了激酶抑制剂来验证哪几条信号通路参与了CagA诱导的CIP2A表达上调效应,此外实施了针对CIP2A的RNA干扰实验,以及干扰后幽门螺杆菌再次感染细胞的实验。通过western blot检测首次在细胞系中阐明了幽门螺杆菌的感染以及细菌源性的癌蛋白CagA诱导细胞的癌蛋白CIP2A表达上调的效应机理。CagA蛋白进入细胞后,激活了Src和MEK/ERK信号途径,并最终导致CIP2A的表达上调。本研究结果为深入理解幽门螺杆菌感染诱发胃癌的分子机制提供了有力的佐证。二、高盐刺激能够增强幽门螺杆菌感染所诱导的CIP2A表达上调本论文中第一部分的实验已经阐明了幽门螺杆菌的感染以及细菌源性的癌蛋白CagA诱导CIP2A表达上调的效应机理,为深入的理解幽门螺杆菌感染导致胃癌发生发展的分子机制提供了线索；同时,环境中高盐因素的刺激也是胃癌高发的危险因素之一,并且高盐饮食可能作为幽门螺杆菌感染导致胃癌的协同刺激因素存在。为了阐明高盐因素刺激幽门螺杆菌后对细菌的包括CagA在内的毒力因子表达的影响,以及高盐刺激后的幽门螺杆菌感染细胞是否比普通幽门螺杆菌感染细胞具有更强的诱导CIP2A表达上调的能力,我们设计了培养基中不同盐浓度刺激幽门螺杆菌后检测相关毒力基因表达量的实验以及高盐刺激后的幽门螺杆菌和普通的幽门螺杆菌分别感染细胞后对CIP2A表达量影响的western blot检测。实验结果表明环境中高盐因素的刺激能够诱导幽门螺杆菌毒力相关基因(cagA、vacA、tlpB、tip-alpha)的表达水平上调,经高盐刺激后毒力增强的细菌感染真核细胞后,可以增强细菌感染细胞所诱导的癌蛋白CIP2A表达上调效应,进而促进胃癌的发生发展；此外,通过对CIP2A分子的检测分析有助于理解高盐饮食和幽门螺杆菌感染在胃癌发生发展过程中发挥协同作用的分子机制。三、EGCG能通过抑制BMX和CIP2A来抑制肿瘤细胞的增殖EGCG抑制肿瘤发生发展的分子机制涉及到众多因子,包括：抑制癌蛋白Myc的表达、抑制基质金属蛋白酶(MMPs)的表达以及对P53和BCL-2等凋亡相关蛋白的影响等。而BMX/Etk酪氨酸激酶和CIP2A属于一类与肿瘤细胞增殖能力相关的重要细胞因子。而迄今为止,具有抗肿瘤活性的绿茶提取物EGCG和BMX激酶以及癌蛋白CIP2A之间的关系尚未实施探讨。因此,研究EGCG与BMX激酶以及癌蛋白CIP2A之间的关系,以及BMX和CIP2A之间的相互调节关系可以帮助我们更深入的理解EGCG在抑制肿瘤细胞增殖过程中发挥作用所涉及的分子机制。基于以上目的,设计了相关实验来验证EGCG作用细胞后对BMX和CIP2A蛋白表达量的影响；应用了真核表达质粒以及siRNA干扰技术来观察BMX和CIP2A之间的相互调控关系；此外,还进行了克隆形成实验来观察CIP2A在EGCG诱导的抑制肿瘤细胞增殖中的作用。实验结果证实了EGCG作用于细胞后可以导致细胞中CIP2A和BMX的表达水平降低,发现了BMX可以正向调控CIP2A的表达,并验证了EGCG发挥抑制肿瘤细胞增殖能力所可能涉及的分子机制。这就为更充分的理解EGCG抑制肿瘤细胞增殖能力的分子机理提供了更详实的依据。