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木瓜蛋白酶(Papain),广泛地存在于番木瓜(Carica papaya)的根、茎、叶和果实内,其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸,属于含巯基(-SH)肽链内切酶,它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点,因此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用。本实验利用离子液体双水相这一新型、绿色的萃取技术来分离木瓜蛋白酶,它综合了离子液体和双水相两者的优点,将温和、高效、可设计性等有效结合。为了研究木瓜蛋白酶在咪唑类离子液体双水相体系中的分配行为,本文选取了咪唑类二腈胺盐和咪唑类醋酸盐两种离子液体,分别考察了它们的成相能力、相平衡数据,通过单因素分析和响应面实验优化萃取木瓜蛋白酶的条件。选取效果最好的一种离子液体双水相体系,建立了该体系中的分配模型并进行了验证,利用SDS-PAGE电泳验证结果,主要内容如下:(1)分别测定两种系列离子液体和不同无机盐组成双水相体系的双节线,发现咪唑类二腈胺盐形成双水相能力比咪唑类醋酸盐强。而无机盐和咪唑类二腈胺盐的成相能力为:Na2C03>K2C03>K2HP04>K3P04>MgSO4>(NH4)2S04>NaH2P04。[Cnmim]Ac(n=2,4,6,8)只能和K2C03、K2HPO4(只有[C2mim]Ac与与K2HPO4不能成相)成相。利用Merchuk方程对双节线数据进行关联,相关系数基本大于0.99。(2)从相图中选取合适的点配制双水相系统,分别测定上下相组分含量。利用Othmer-Tobias和Bancroft经验方程对数据进行关联,相关系数均大于0.99,标准偏差均小于6.75%,说明试验所选方程适用于[Cnmim]Ac(n=4,6,8)-K2HPO4和[Cnmim]N(CN)2-K2HP04离子液体双水相相平衡数据的关联。(3)测定无机盐及其浓度对木瓜蛋白酶活力的影响。MgS04、K2HP04和NaH2P04的浓度变化没有引起酶活力的大变化,而且在一定程度上提高了酶的活力。而(NH4)2S04、K3P04、Na2C03、K2CO3随浓度增大会抑制酶的活力,甚至在高浓度会破坏酶的空间结构。(4)通过对各单因素的考察可知,[Cnmim]Ac(n=4,6,8)-K2HP04和[Cnmim]N(CN)2-K2HP04离子液体双水相对木瓜蛋白酶的萃取效果。通过考察离子液体浓度、盐浓度、pH这三个因素对木瓜蛋白酶在双水相中分配行为影响,采用响应面法优化,得到最佳萃取条件为:[C8mim]Ac质量分数27.79%、K2HP04质量分数20.09%、pH=8.88,分配系数和酶活回收率可以达到最大,分配系数为11.65,酶活回收率为88%。(5)在上述试验的基础上,测定上下相各组分浓度以及分配系数K,考察各组分浓度与分配系数的相关度。分配系数与上下相离子液体浓度差、盐浓度差的相关度均大于0.84,可用于分配模型的建立。关联lnK与上下相的浓度差得:模型拟合相关系数均大于0.9757,相对偏差在均小于5%,通过验证,该模型能准确的预测木瓜蛋白酶在该体系中的分配行为。本课题的研究为制备高纯高活的木瓜蛋白酶提供了新方法和理论基础,为建立生物活性物质在离子液体双水相中的分配模型提供理论指导,对解决目前制约木瓜蛋白酶纯化技术的关键问题的具有一定的帮助。