脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,约占颅脑肿瘤的30%-50%,复发率居颅内肿瘤首位。由于胶质瘤具有高度侵袭性,高度异质性和高度血管化的特点,在过去的30年里,尽管显微神经外科技术、放射治疗及化疗水平的不断提高,但其平均生存期仍不足12个月,且手术创伤及放化疗又对脑组织产生继发性损害。因此,胶质瘤的治疗目前仍是医学界的一个难题,探索脑胶质瘤新的治疗方法十分必要。肿瘤的免疫毒素治疗是最近十几年发展起来的新疗法。免疫毒素(Immunotoxins, ITs)是将具有导向能力的肿瘤特异性分子与毒素蛋白联而成的一种杂合分子。由于导向分子可以特异地识别肿瘤细胞,所以免疫毒素在体内可以像“导弹”一样定向寻找肿瘤细胞,并将其杀死,但同时对正常组织又不会造成损伤,因此又被称为肿瘤治疗的“生物导弹”。用于构建免疫毒素“弹头”的是毒素蛋白,如绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin,PE)、白喉毒素(Diphtheria toxin, DT)以及蓖麻毒素(Ricin)。这些毒素分子对细胞的杀伤能力非常强,一般认为,只要一个毒素分子进入细胞,就可以使该细胞死亡,而且肿瘤细胞一般不会对毒素产生耐药性。由于免疫毒素疗法采取的是一种杀伤性策略,避免了停药后复发和肿瘤产生耐药性的缺点,是极具潜力的一种抗肿瘤治疗方法。目前大量的实验研究已证实免疫毒素抗肿瘤治疗的可靠性和优越性。导向分子是免疫毒素治疗的基础,免疫毒素对肿瘤特异性的杀伤作用依赖于肿瘤细胞上特异性表达的标志物。EphA2是受体酪氨酸激酶家族(Receptor Tyrosine Kinase, RTKs)中的一员,其特异性的配体为Ephrin Al。EphA2在成人各种正常上皮细胞中几乎不表达,而在恶性肿瘤细胞中如恶性胶质瘤、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、高侵袭性黑色素瘤中则过度异常表达。最近发现EphA2显示在恶性胶质瘤细胞和组织中呈高表达,而在正常脑组织中几乎没有表达,而且EphA2蛋白高表达与患者预后显著相关,是胶质瘤特异性的标志物之一。免疫毒素靶向治疗肿瘤需要考虑的一个关键问题是如何确保免疫毒素选择性地靶向杀伤肿瘤组织而且保护周围的正常组织免受“误伤”。传统的免疫毒素虽然也能够选择性的靶向杀伤肿瘤细胞,但是由于其天然的局限性：(a)难以渗透到肿瘤局部并达到一定的药物浓度；(b)在非靶点组织的聚集降低了耐药浓度且缩窄了治疗窗口,因此临床应用受到很大的限制。因此,选择合适的载体工具使免疫毒素在肿瘤内起作用显得非常重要。骨髓间充质干细胞(MSCs)具有取材方法简单,体外扩增容易,外源基因表达稳定,可自体取材避免免疫排斥反应以及异体干细胞移植可能出现的伦理问题等诸多优点,为我们展示了良好的研究及应用前景。大量文献已经证实骨髓间充质干细胞具有神经干细胞的所有特点,如迁移能力和肿瘤趋化作用,可以作为良好的基因治疗运载工具。根据这一特点,将胶质瘤细胞特异性的免疫毒素基因转染骨髓间充质干细胞(MSCs),使其成为能够分泌产生免疫毒素的细胞,可将免疫毒素基因带到肿瘤局部持续表达并发挥作用。本研究小组前期已经成功构建VEGF-PE38免疫毒素并在人骨髓间充质细胞内表达,证实了基因治疗中人骨髓间充质细胞作为免疫毒素载体细胞的可行性。基于以上背景,我们提出骨髓间充质干细胞介导的特异性重组免疫毒素EphrinA1-PE38靶向治疗胶质瘤可能性。本项目首先构建EphA2配体(EphrinA1)、绿脓杆菌外毒素PE38组成的特异性免疫毒素EphrinA1-PE38腺病毒载体,体外转染骨髓间充质干细胞,实验证实骨髓间充质干细胞分泌的EphrinA1-PE38能够特异性地靶向杀伤胶质瘤细胞,再将表达该特异性免疫毒素的间充质干细胞回输体内,利用间充质干细胞的趋瘤性,实现在肿瘤组织局部持续表达特异性免疫毒素EphrinA1-PE38,从而对胶质瘤细胞产生特异性杀伤效应,为胶质瘤靶向治疗探讨新的治疗策略。本研究主要包括四部分。第一章重组腺病毒载体pAd-EphrinAl-PE38的构建及包装目的：构建携带免疫毒素EphrinA1-PE38的重组腺病毒载体,并进行包装、鉴定、纯化及滴度测定,为靶向毒素治疗胶质瘤研究奠定物质基础。方法：通过PCR获得EphrinA1胞外端基因片段和绿脓杆菌外毒素衍生物PE38基因,酶切并测序鉴定；再通过适当的酶切及连接反应,构建出穿梭质粒pAdTrack-EphrinA1-PE38,氯化钙法制备含有骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,重组质粒经限制性内切酶及DNA测序验证。用限制性内切酶Pmel线性化处理后与上述感受态细胞在细菌中进行同源性重组,构建重组腺病毒载pAd-EphrinA1-PE38。PacI线性化处理后在人胚肾细胞(HEK293)中进行包装,PCR法对重组子进行鉴定、倍比稀释法检测病毒滴度。结果：经酶切及测序验证,成功PCR获得本实验需要的EphrinA1胞外端基因片段及PE38基因片段；酶切分析及DNA序列测定证实,EphrinA1-PE38融合基因被成功克隆入腺病毒表达质粒载体,经过细菌内同源性重组,成功构建重组腺病毒载体pAd-EphrinA1-PE38;并在KEK293细胞中完成包装；倍比稀释法检测病毒滴度达至109pfu/mL数量级。结论：本研究成功在细菌内同源性重组构建重组腺病毒载体pAd-EphrinA1-PE38,并利用HEK293细胞包装成腺病毒,为后续靶向细胞毒性及抗肿瘤作用奠定基础。第二章分泌EphrinA1-PE38的骨髓间充质干细胞的建立目的：建立人骨髓间充质干细胞体外分离、培养方法；观察重组腺病毒Ad-EphrinA1-PE38感染hMSCs的效率、对hMSCs细胞增殖的影响以及日的基因的表达。方法：应用密度梯度离心法分离人hMSCs,条件培养基培养。倒置相差显微镜下观察hMSCs形态学变化；流式细胞仪检测hMSCs的表面标记以及细胞周期。以不同感染复数(multiplicity of infection, MOI)的腺病毒的Ad-EphrinA1-PE38感染hMSCs,荧光显微镜观察转染效率、CCK-8法检测IhMSCs的增殖、RT-PCR法及ELISA法分别从转录水平和蛋白水平检测感染Ad-EphrinA1-PE38后目的基因在hMSCs中的表达分泌。所有数据采用均数±标准误(x+SE)表示,并用统计软件SPSS13.0进行统计分析。用析因方差分析不同MOI的Ad-EphrinA1-PE38感染对hMSCs曾殖的影响,用单因素方差分析对不同MOI的Ad-EphrinA1-PE38感染后hMSCs分泌的EphrinA1-PE38进行统计分析。P<0.05为差异有统计意义。结果：用密度梯度离心法成功地分离培养出了hMSCs。典型的hMSCs贴壁生长,以长梭形为主,体积小,核浆比大,呈明显的同向性排列。流式检测结果显示：hMSCs高表达粘附分子CD29(97.77%),CD44(92.73%)及CD105(90.94%)；低表达造血系细胞表面标记物CD34(1.4%),CD45(0.07%)和人类白细胞抗原HLA-DR (0.14%). hMSCs的S+G2+M期的细胞为18.3%,大部分细胞仍是处于静止状态,说明hMSCs具有较强的增殖能力。Ad-EphrinA1-PE38感染后24h即可见绿色荧光(GFP),此后荧光逐渐增多,7d荧光表达最强。7d时感染复数(MOI)分别为100、400、800、1200的病毒感染率分别为：24%、43%、88%、90%。不同MOI的Ad-EphrinA1-PE38感染对hMSCs增殖的影响有显著性差异(F=36.839,P=0.000)。进一步用单因素方差分析(one-way ANOVA)对每一个时间点各MOI的Ad-EphrinA1-PE38感染对hMSCs曾殖进行多重比较。除dl、d2外,d3、d4、d5、d6、d7各组hMSCs的增殖具有显著性差异,F值分别为：3.593、6.464、7.180、10.277、14.385,P值均<0.05；1200MOI组hMSCs曾殖显著低于其余各组,未感染组(UT)组与100、400、800MOI组与无显著性差异(P>0.05)说明感染复数(MOI)在800以下时,对细胞活力无显著影响,当病毒感染复数(MOI)达到1200时,对细胞增殖产生抑制。RT-PCR可以检测到约700bp的目的基因的表达条带。ELISA结果经统计学分析发现：不同MOI的Ad-EphrinA1-PE38感染hMSCs分泌EphrinA1-PE38的量具有显著性差异(F=59.773,P=0.000),800MOI组与100MOI、400MOI组之间有显著性差异(P<0.05)；而800MOI、1200MOI组之间无显著性差异(P>0.05)。取MOI=800的Ad-EphrinA1-PE38感染hMSCs细胞,3天后即可检测至EphrinA1-PE38的分泌,第6天达到高峰并持续约12天,此后2phrinA1-PE38的分泌开始下降,33d仍有分泌。结论：本研究通过密度梯度离心法成功分离出具有较高纯度的hMSCs,细胞免疫表型与典型MSCs相似。合适感染复数的重组腺病毒Ad-EphrinA1-PE38可以有效感染hMSCs,对hMSCs的细胞增殖无明显影响。感染Ad-EphrinA1-PE38的hMSCs能够在一定时间内持续分泌一定量的EphrinA1-PE38。第三章骨髓间充质干细胞分泌的EphrinAl-PE38对胶质瘤细胞的选择性杀伤作用目的：观察hMSCs分泌的重组免疫毒素EphrinAl-PE38对EphA2阳性的人胶质瘤细胞的特异性细胞毒作用,同时探讨其可能的作用机制。方法：首先利用Western Blot检测EphA2受体在不同人胶质瘤细胞株(U251、A172、SHG44、U87)上的表达。为检测EphrinA1-PE38对EphA2(?)性的胶质瘤细胞的特异性杀伤效应,将U251细胞及EphA2阴性对照细胞T47D及EphA2表达抑制的U251[EphrinA1](+)细胞按1×104/每孔均匀铺于96孔板,加入不同剂量(12.5μl、25μl、50μl、100μl)的感染Ad-EphrinA1-PE38的hMSCs细胞培养上清,继续培养72小时,CCK-8法检测EphrinA1-PE38对靶细胞的增殖影响；为进一步检测EphrinA1-PE38细胞毒作用的靶向性,EphrinA1-PE38上清加入U251细胞前以EphrinA1抗体预孵育1h,观察其能否拮抗EphrinA1-PE38对U251细胞的杀伤作用。TUNEL法和Annexin V-PI法检测EphrinA1-PE38诱导U251细胞的凋亡作用。所有数据采用均数±标准误(x±SE)表示,并用统计软件SPSS13.0进行统计分析。用析因方差分析EphrinA1-PE38对EphA2P日性及EphA2阴性的瘤细胞的选择性杀伤效应。EphrinA1-PE38感染上清和未感染hMSCs上清诱导U251细胞凋亡的组间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计意义。结果：Western Bolt检测发现EphA2受体在人胶质瘤细胞株U251、A172、SHG44中高表达,在U87中表达较低,但仍高于正常水平；而在阴性对照肿瘤细胞T47D以及正常细胞hMSCs中,未检测出EphA2受体的表达；转染EphrinA1基因的U251[EphrinAl](+)细胞几乎没有EphA2受体的表达。CCK-8法检测EphrinA1-PE38上清对胶质瘤细胞具有选择性杀伤效应,析因方差分析显示：不同浓度细胞感染上清对U251的增殖抑制效应之间均有统计学差异(F=175.828,P=0.000)；感染上清对EphA2阴性的T47D细胞的增殖抑制效应之间无统计学差异(F=0.855,P=0.078)；对EphA2表达抑制的U251[EphrinA1](+)细胞同样没有显著的杀伤效应,不同浓度细胞感染上清对U251[EphrinA1](+)细胞的增殖抑制效应之间无统计学差异(F=2.255,P=0.070)。抗体中和实验表明,EphrinA1抗体能够拮抗EphrinA1-PE38对U251细胞的杀伤作用(F=84.596,P=0.000)。TUNEL检测结果表明EphrinA1-PE38上清显著促进U251凋亡,EphrinA1-PE38感染上清处理组U251细胞凋亡率为(39.44±8.86)%,与对照组未感染hMSCs上清组的凋亡率(4.39±1.42)%相比,凋亡率显著增高,差异具有统计学意义(t=-8.731,P=0.000)。Annexin V-PI流式检测结果与TUNEL结果基本一致,感染上清处理组显著高于未感染组。结论：hMSCs分泌的重组免疫毒素EphrinA1-PE38对EphA2阳性的胶质瘤具有特异性杀伤效应,EphrinA1-PE38对胶质瘤细胞特异性杀伤过程中,诱导靶细胞发生凋亡。第四章分泌EphrinAl-PE38的骨髓间充质干细胞体内移植对胶质瘤生长的抑制作用目的：观察hMSCs分泌的重组免疫毒素EphrinA1-PE38对U251移植瘤生长的影响并对其作用机制做初步研究,探讨hMSCs作为靶向毒素基因治疗负载体系的可行性。方法：体外培养人胶质瘤U251细胞,建立裸鼠皮下移植瘤模型。一周后实验动物随机分为三组：PBS组、单纯hMSCs移植组、hMSCs-EphrinAl-PE38移植组；荷瘤裸鼠接受瘤内细胞移植,三组分别组瘤内注射10μl PBS,lxl06hMSCs (10μl)、1×106感染Ad-EphrinAl-PE38的hMSCs (10μl)。每隔3～4天测量皮下移植瘤体的大小一次,绘制肿瘤生长曲线。采用ELISA法检测肿瘤组织中EphrinAl-PE38的的分泌变化。肿瘤组织冰冻切片处理后,荧光显微镜下观察hMSCs--EphrinAl-PE38在肿瘤组织内的存在情况。为检测肿瘤组织凋亡,免疫荧光法检测各组裸鼠肿瘤中Caspase-3和Ki-67的表达。所有数据采用均数±标准误(x±SE)表示,并用统计软件SPSS13.0进行统计分析。各实验组肿瘤体积变化采用重复测量方差分析,不同时间点的组间比较前首先进行方差齐性检验,若方差齐性,采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间的多重比较采用LSD分析,若方差不齐,采用Welch校正的方差分析,组间的多重比较采用Dunnett’sT3分析。结果：各组给予不同治疗后,在不同时间点对移植性人脑胶质瘤模型肿瘤体积观测,经重复测量方差分析,表明各组移植性人脑胶质瘤肿瘤体积显示出显著的分组效应(F=93.296,P<0.001)和时间效应(F=212.394,P<0.001)以及分组与时间的交互效应(F=24.308,P<0.001),说明不同治疗方法和时间因素对各组荷瘤裸鼠移植瘤体积有影响,组间差异大小在不同时间点不一样。进一步用单因素方差分析对每一个时间点各组动物的移植瘤体积进行多重比较。结果发现从接种肿瘤后第12天开始三组荷瘤裸鼠肿瘤体积具有显著差异,hMSCs-EphrinAl-PE38细胞移植组肿瘤体积明显比单纯hMSCs移植组和PBS对照组小,差异具有统计学意义(P<0.05),且随着时间延长越来越显著,表明hMSCs-EphrinAl-PE38细胞移植对裸鼠U251胶质瘤生长具有明显的抑制作用。单纯hMSCs移植组和PBS对照组之间相比较,单纯hMSCs移植组荷瘤裸鼠肿瘤体积虽然较PBS对照组生长缓慢,但二者之间并无统计学差异(P>0.05)。ELISA发现移植后第2天即可在肿瘤组织内检测到感染后hMSCs分泌的EphrinAl-PE38,第5天达到高峰,随即下降。肿瘤组织冰冻切片在荧光显微镜下可见散在分布的绿色荧光蛋白GFP标记hMSCs-EphrinAl-PE38细胞,单纯hMSCs组及PBS对照组肿瘤组织标本内未见到绿色荧光蛋白的表达。用cleaved caspase-3和ki-67抗体对肿瘤组织进行免疫荧光染色。计数被标记的阳性细胞率,经单因素方差分析,不同处理组肿瘤组织凋亡情况具有显著性差异,hMSCs-EphrinA1-PE38细胞移植组肿瘤组织cleaved caspase-3阳性细胞显著增多(F=7.797,P=0.015),ki-67阳性细胞显著减少(F=6.913,P=0.010),较单纯hMSCs组及PBS对照组有统计学差异(P<0.05)结论：瘤内注射hMSCs-EphrinA1-PE38细胞能够显著抑制胶质瘤生长,其抗肿瘤效应一定程度上免疫毒素诱导细胞发生凋亡有关