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碱性磷酸酶广泛存在于动物、植物、微生物中,在生物体内直接参与了磷酸基团的转移和代谢过程,而且还与角蛋白等蛋白质的分泌,DNA、RNA、脂质等代谢有关,它对钙质吸收、骨骼形成、磷酸钙沉积都起着重要作用。提纯的ALP常用于核酸的研究,是基因工程常用的工具酶,也是酶标免疫测定的常用工具酶之一。添加ALP的化妆品更有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢。人类血清中的ALP在不同的疾病状态下有显著变化,临床上将血清ALP变化指标作为诊断某些疾病的依据。目前国内外学者对多种贝类及几种鱼类的ALP进行了研究,但对无胃鱼类白鲢ALP的研究未见报道。白鲢(Hypophthalmichthys molitrix)学名鲢,又叫扁鱼、鲢子,属于鲤形目,鲤科,鲢亚科,鲢属,是著名的四大家鱼之一,具有广泛的地理分布和重要的经济价值。本研究以白鲢为原料,对比其各内脏组织中碱性磷酸酶的分布,并从酶活力比较高的肠中分离纯化碱性磷酸酶,对其理化性质、必需功能基团进行研究,探讨该酶活力调控机理,一方面为白鲢畅碱性磷酸酶在分子克隆和酶标诊断试剂中的应用提供理论基础;另一方面可以将白鲢内脏的利用价值得到开发,提高其经济价值。研究结果如下:1.白鲢四种内脏组织碱性磷酸酶比较酶学研究通过对白鲢心脏、肝脏、肠、肾脏、四种组织中碱性磷酸酶酶活力的检测比较,发现肠中该酶总活力最高。2.白鲢肠碱性磷酸酶的分离纯化以白鲢肠为酶提取材料,经Tris-HCl缓冲液(pH8.5)抽提,正丁醇处理,60%硫酸铵沉淀分离,超滤脱盐除去部分杂蛋白及盐离子,DEAE-Sepharose离子交换柱层系,Superdex-200凝胶过滤纯化,从白鲢肠液中分离纯化出电泳纯的碱性磷酸酶。该酶提纯倍数为105.08,比活力达到4031.15U/mg。3.白鲢肠ALP性质研究ALP的分子量为135.4kDa,由两个相同的亚基组成,亚基分子量为67.3kDa;其等电点是5.31。该酶催化磷酸苯二钠的水解反应,反应的米式常数(Km)和最大速度常数(Vm)分别为0.473mmol/L和14.35μmol/(L·min):最适温度是25℃。温度高于50度不稳定;最适pH值为10.2,pH小于7和大于12均不稳定;金属离子对该酶的作用效果不同,正一价的粒子对酶活力影响不大,而在正二价离子中Mg2+、Ca2+对酶有激活作用,Cu2+、Zn2+对酶活力有抑制作用;有机溶剂甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇对该酶有抑制作用。HPO42-是碱性磷酸酶催化磷酸苯二钠的产物之一,WO43-是产物类似物,它们对酶有较强的抑制作用,其中10mmol/L的HPO42-,使酶活仅余30%,而10mmol/L的WO43-使酶活仅余33%。他们对酶活性的抑制类型均为竞争性抑制。4.白鲢肠ALP功能基团的研究用PCMB、NBS、PMSF、TNBS、SUAN、DTT及IAc在一定条件下选择性修饰该酶的巯基、氨酸残基、丝氨酸残基、氨基和蛋白分子中的二硫键,并对酶活力的变化作出测定。结果表明,NBS、PMSF、SUAN、DTT和IAc的修饰能显著抑制酶的活性。且酶活力降低程度与修饰剂的浓度相关;PCMB的修饰不表现对酶的抑制作用。初步认为,Ser、Lys和Trp残基为白鲢碱性磷酸酶的必需功能基团,部分二硫键对保护酶的催化能力是必需的。