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禽致病性大肠杆菌（avainpathogenic Escherichia coli,APEC）会引起鸡大肠杆菌病,常诱发心包炎、肝周炎、气囊炎、卵黄性腹膜炎等,造成严重的经济损失,阻碍家禽养殖业的健康发展。鸡白痢沙门氏菌（Salnmoella enterica serovar Pullorum,S.Pullorum）和鸡伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Gallinarum,S.Gallinarum）是危害养鸡业发展的重要病原菌,该类病原菌可通过水平/垂直传播,主要感染3周龄以内的雏鸡,对青年鸡和成年鸡同样会造成不良影响,如下痢、产蛋率下降等。基于目前限制抗生素使用的要求,寻找一个安全、有效的免疫方法来防治禽致病性大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌感染是亟需解决的问题。本实验室前期研究结果表明,表达APECI型菌毛的重组鸡伤寒沙门氏菌SG9R（pYA3342-fim）对鸡群预防禽致病性大肠杆菌感染具有60%的免疫保护力,考虑到SG9R菌株对1月龄雏鸡有一定的致病性影响,尚未应用于3周龄以内的雏鸡。因此,本研究基于上述表达APECI型菌毛的重组鸡伤寒沙门氏菌SG9R（pYA3342-fim）构建其αroA基因缺失株,并对其致弱性缺失株的安全性和保护效果进行探究。旨在为开发有效预防禽大肠杆菌病和鸡沙门氏菌病的多联基因工程减毒疫苗及沙门氏菌疫苗载体奠定基础。1.表达APECI型菌毛的重组鸡伤寒沙门氏菌SG9R（pYA3342-fim）基因缺失株的构建及其生物学特性研究通过比对NCBI GenBank上不同沙门氏菌菌株的αroA基因序列,设计两对PCR引物,分别用于扩增鉴定重组鸡伤寒沙门氏菌SG9R（pYA3342-fim）中的αroA编码基因,以及用于扩增Red同源重组的缺失靶基因同源臂,即该缺失靶基因的5’端序列与αroA两翼序列同源,3’端序列与pKD3上cat基因序列两翼同源。利用Red同源重组技术,成功构建含氯霉素抗性基因的αroA基因缺失一次重组菌SG9R（pYA3342-fim）△αroA::cat。进一步导入含FLP重组酶的pCP20质粒,去除氯霉素抗性片段,最终成功构建αroA基因缺失株SG9R（pYA3342-fim）△αroA。通过基因克隆技术,将αroA基因克隆至表达质粒载体pBR322并转化至αroA缺失株SG9R（pYA3342-fim）△αroA中,成功构建αroA基因回补株SG9R（pYA3342-fiim）△αroA/pαroA。在此基础上,常规糖发酵试验和氨基酸利用试验等生化反 应 检 测 结 果 显 示 SG9R（pYA3342-fim）、SG9R（pYA3342-fim）△αroA 和SG9R（pYA3342-fim）△αroA/pαroA生化特性保持一致,表明αroA基因缺失对细菌生长代谢没有显著影响;生长曲线测定结果表明αroA基因缺失会一定程度减慢SG9R（pYA3342-fim）在体外的增殖速度;甘露糖敏感血凝和血凝抑制结果表明,这三株菌均能和鸡红细胞发生明显的凝集反应,并且凝集活性能被D-甘露糖抑制,表明该重组菌SG9R（pYA3342-fim）成功表达大肠杆菌APECI型菌毛;αroA缺失株即SG9R（pYA3342-fim）△αroA的遗传稳定性经30代测试结果表明该缺失株具有良好的遗传稳定性;微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）结果显示这三株菌对头孢菌素、链霉素、庆大霉素、多西环素、氟苯尼考、多粘菌素、美罗培南、恩诺沙星及环丙沙星均敏感,表明αroA基因缺失不会导致细菌耐药性的产生。表达APECI型菌毛的重组鸡伤寒沙门氏菌SG9R（pYA3342-fim）αroA基因缺失株的成功构建为后续进一步探究αroA基因缺失减毒活疫苗安全性评估研究奠定基础。2.表达APECI型菌毛的重组鸡伤寒沙门氏菌SG9R（pYA3342-fim）基因缺失株的安全效力评估为探究重组鸡伤寒沙门氏菌SG9R（pYA3342-fim）△αroA作为活疫苗候选株的安全性和潜在应用价值,本试验研究对该缺失株进行了安全性评价和免疫保护研究。将 1 日龄 SPF 鸡（n=50）随机分成 10 组,即 SG9R（pYA3342-fim）、SG9R（pYA3342-fim）△αroA、SG9R（pYA3342-fim）△αroA/pαroA 分别以 1×108cfu、1×109cfu、1 ×1010fu的剂量经口服途径对鸡进行免疫,另设PBS对照组,每组5羽,免疫剂量为0.2mL/羽。结果显示:原型疫苗株SG9R（pYA3342-fim）1×108cfu、1×109cfu剂量组的鸡都健康,无不良反应,而1×1010cfu剂量组的5只鸡有2只鸡在24h内出现羽毛疏松、精神沉郁等症状,36h后食欲恢复正常、精神状态转好,未出现死亡。缺失株SG9R（pYA3342-fim）△αroA 1×108cfu、1×109cfu、1×1010cfu各剂量组的鸡都健康,无不良反应。回补菌株SG9R（pYA3342-fim）△αroA/pαroA 1×108cfu、1×109cfu 剂量组的鸡都健康,无不良反应,而1×1O10cfu剂量组的5只鸡有1只鸡在24h内出现羽毛疏松、精神沉郁等症状,36h后食欲恢复正常、精神状态转好,未出现死亡。这三株菌的安全性评价结果表明αroA基因缺失株SG9R（pYA3342-fim）△αroA 比 原 型 疫 苗 株 SG9R（pYA3342-fim）和 回 补 株SG9R（pYA3342-fim）△αroA/paαroA更加安全,1×109cfu是较为安全的剂量。结合文献资料信息和本试验结果,确定下一步免疫保护试验的免疫剂量为1×109cfu。将1日龄SPF鸡（n=75）随机分成5组,即SG9R（pYA3342-fim）免疫组、SG9R（pYA3342-fim）△αroA 免疫组、SG9R（pYA3342-fim）△αroA/paαroA 免疫组、PBS 攻毒对照组、正常对照组,每组15羽。以口服途径对各组1日龄的鸡进行初次免疫,免疫剂量为]×109cfu,初次免疫2周后,以相同免疫剂量和途径对各组鸡进行二次免疫,二次免疫2周后,以相同免疫剂量和途径对各组鸡进行三次免疫。结果显示:SG9R（pYA3342-fim）、SG9R（pYA3342-fim）△αroA、SG9R（pYA3342-fim）△aarA/pαroA,对鸡的日增重无显著影响,也不影响鸡的采食量、精神状况。三次免疫2周后,用1×1010cfu的禽致病性大肠杆菌强毒株QD2（血清型078）通过后胸气囊接种方式对各试验组鸡群经进行攻毒,SG9R（pYA3342-fim）、SG9R（pYA3342-fim）△αroA 和 SG9R（pYA3342-fim）△αroA/parA 免疫组以及PBS攻毒对照组的鸡的死亡率分别为33.3%、20%、26.7%、66.7%;用1×1010cfu的鸡白痢沙门氏菌强毒分离株SP03经口服途径对各试验组鸡群进行攻毒,SG9R（pYA3342-fim）、SG9R（pYA3342-fim）△αroA 和 SG9R（pYA3342-fim）△αroA/parA 免疫组以及PBS攻毒对照组的发病率分别为46.7%、33.3%、40%、73.3%。临床剖检和病理组织石 蜡 切 片 观 察 发 现 SG9R（pYA3342-fim）、SG9R（pYA3342-fim）△αroA、SG9R（pYA3342-fim）△αroA/pαroA免疫组的鸡攻毒后的临床症状和心脏、肝脏及脾脏组织的病变程度较攻毒对照组的显著减轻。免疫保护试验结果表明,重组鸡伤寒沙门氏菌SG9R（pYA3342-fim）△αroA缺失株作为减毒活疫苗候选株能够有效地预防禽致病性大肠杆菌的感染,对鸡白痢沙门氏菌的感染也能起到有效的交叉保护作用。