灵芝是一种珍贵的高等药用真菌和名贵中草药,用它来预防和治疗疾病已有几千年历史。灵芝酸和灵芝多糖作为灵芝的重要药用成分,具有抗癌、抗爱滋病、提高免疫力等活性。由于其重要的药理作用,近年来灵芝成为国内外研究的一个热点。尽管关于加速灵芝细胞生长和优化灵芝酸与灵芝多糖生产有一些报道,目前二者低生产率仍然是制约其产业化生产的核心问题之一。先前提高灵芝酸与灵芝多糖产量的报道主要集中在培养条件优化、诱导剂添加和内源基因(灵芝酸和灵芝多糖合成通路中基因,hmgr,sqs,ugp.pgm)高表达方面,而通过转化外源基因提高灵芝酸与灵芝多糖产量的方法还未见报道。透明颤菌血红蛋白(VHb)是一种二聚体氧结合蛋白,能够增强细胞的呼吸作用。因而在工业化生产中用来提高细胞密度、增强代谢合成等。VHb在异源宿主中表达可提高氧的代谢水平,蛋白质合成速度,加速生物修复和代谢产物的积累,有利于高密度培养中细胞的生长等。透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在灵芝细胞中的表达是由灵芝的三磷酸甘油醛脱氢酶基因强启动子调控的。VHb的活性检测采用CO差光谱法—VHb结合CO后在419nm处有最大吸收峰。本文通过在灵芝细胞中异源表达透明颤菌血红蛋白(VHb)提高了灵芝酸和灵芝多糖的产量。通过研究转vgb灵芝细胞在悬浮发酵条件下表达VHb对灵芝酸的生物合成、中间代谢产物积累以及灵芝酸合成途径中关键基因表达水平的影响。结果表明,在表达VHb的菌株中四种灵芝酸单体GA-S,GA-MK,GA-Me和GA-T的最大含量为19.1±1.8,191.5±1 3.1,45.2±2.8和34.6±2.1μg/100 mg细胞干重,分别是野生型(WT)菌株中含量的1.4,1.9,2.0和2.2倍。灵芝酸中间代谢产物羊毛甾醇(LS)的最大含量VHb表达菌株中是WT菌株中的83%。VHb表达菌株中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(hmgr),鲨烯合酶基因(sqs)和羊毛甾醇合成酶基因(ls)的转录水平分别提高了1.6,1.5和1.6倍。同时研究了在表达VHb的菌株中胞内多糖(IPS)、胞外多糖(EPS)产量以及多糖合成相关基因的表达情况。其中胞内多糖(IPS)、胞外多糖(EPS)产量分别达到26.4 mg/100mg细胞干重和0.83g/L,比WT菌株中分别高出30.5%和88.2%。在表达VHb的菌株中葡萄糖磷酸变位酶基因(pgm),尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(ugp)以及β-1,3-葡聚糖合成酶基因(gls)的表达水平相比WT菌株分别提高了1.51,1.55,3.38倍。在这项研究中,构建的表达VHb的工程菌株中同时提高了灵芝酸和灵芝多糖的生物合成,因此,表达VHb的工程菌株在大规模发酵生产中对于提高灵芝酸和灵芝多糖的产量方面具有重要意义。