研究背景：骨肉瘤(osteosarcoma)是骨组织中最常见的一种恶性程度高的骨肿瘤,其发生很可能起源于成骨细胞终末分化以及骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的过程中。骨肉瘤细胞具有显著的早期迁移能力与局部侵袭性,而这一特性也成为了骨肉瘤患者晚期致死的主要原因。因此深入研究骨肉瘤细胞的凋亡、分化及侵袭迁移等过程的信号通路,并寻找可以有效的逆转肿瘤细胞发生发展的分子靶点,可为骨肉瘤治疗及肿瘤转移抑制提供有价值的理论和实验依据。研究表明,配体依赖转录因子核激素受体超家族的成员过氧化物酶体增殖活化受体(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR) Y对多种肿瘤细胞凋亡和分化起着重要调控作用。近年来研究显示,植物雌激素具有预防和抑制多种肿瘤,如乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、结肠癌等的作用。作为PPARY激动剂配体的植物雌激素成员之一的大豆苷元(daidzein, DAI),是一种从日常豆类食品中提取出来的黄酮类化合物,其药理作用丰富,可诱导肿瘤细胞的凋亡、分化,且可抑制肿瘤迁移及癌组织血管生成的相关基因,但其机制目前尚未完全阐明。因此,探讨DAI对人骨肉瘤细胞的凋亡、分化及生物学性状的影响,揭示其作用机制,将为骨肉瘤的临床治疗提供新的思路和策略。研究目的：本研究选择人骨肉瘤细胞MG63为实验对象,探讨不同浓度的植物雌激素DAI对MG63细胞增殖活力、凋亡及细胞侵袭、迁移等生物学性状的影响；同时观察低浓度的DAI对MG63细胞诱导分化的作用及其可能的分子机制。以期对恶性肿瘤的治疗找到更适合的毒性更小的方法和策略,为临床治疗提供更多实验依据。方法：1.采用噻唑蓝(MTT)比色法检测浓度为0μM、1μM、10μM、20μM、40μM、80gM和160μM的DAI在不同时间内对MG63细胞增殖的影响。2. AV-FITC/PI双荧光标记流式细胞术检测浓度为0μM、20μM和80gM的DAI作用24h和48h,细胞早期凋亡情况。3. Tune1法检测DAI对MG63细胞凋亡的影响。4.实时荧光定量PCR (Q-PCR)检测浓度为0μM、20μM、40μM和80gM的DAI干预后,细胞凋亡与分化等相关基因表达量的变化。5.磷酸苯二钠法测定不同浓度的DAI干预后,细胞内碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)表达活性的改变。6.微量酶联免疫法(ELISAL)检测不同浓度的DAI干预后,I型胶原含量的变化。7.茜素红染色法观察不同浓度DAI干预后,MG63细胞内钙盐沉积的情况。8.划痕实验观察浓度为0μM、20μM、40μM和80μM的DAI对MG63细胞迁移的影响。9. Transwell侵袭实验观察浓度为0μM、20μM、40μM和80μM的DAI对MG63细胞侵袭能力的影响。10.免疫细胞化学技术(immunocytochemistry, SP)检测0μM、20μM、40μM和80gM的DAI干预后MG63细胞侵袭迁移及凋亡相关蛋白表达的变化。结果：1)MTT检测结果显示：DAI可以抑制细胞的增殖活力,且随着药物浓度的增加和作用时间的延长,抑制作用增强,各组间比较其差异有统计学意义(P<0.01)。2) AV-FITC/PI双荧光标记流式细胞术检测结果显示：不同浓度的DA1分别干预MG63细胞24h和48h后,干预组的凋亡率较对照组均升高(P<0.01),其中80μM组的凋亡率明显高于20gM及对照组；80μM浓度时,48h凋亡率显著高于24h。3) Tunel检测结果显示：DAI干预MG63细胞后,各干预组细胞凋亡阳性染色结果均高于对照组(P<0.01),且阳性率与DAI浓度呈正相关。4) qPCR检测结果显示：各浓度组DAI干预MG63细胞48h后,PPARy表达量较对照组均升高(P<0.01),且随干预浓度增加而增强,而Runx2的表达含量较对照组降低(P<0.01)。5)碱性磷酸酶(ALP)检测结果显示：10μM、20μM和40gM低浓度的DAI作用于细胞6d、9d和12d后,三个时间点检测ALP活性较对照组均升高,且在DAI作用的浓度区间内ALP活性与干预细胞的DAI浓度呈正相关,在9d其活性到达峰值(P<0.01)6)Ⅰ型胶原蛋白检测结果显示：10μM、20μM和40gM低浓度的DAI作用的MG63细胞I型胶原的相对表达含量均高于对照组(P<0.01),经同一时间点组间两两比较,除了1d和24d的20μ M与40μM组无显著差异外其它各组间均有差异(P<0.05)。I型胶原的相对含量可随DAI作用时间延长而有所升高。7)茜素红染色检测显示：10μM、20μM及40μM低浓度的DAI干预MG63细胞20d后,加药组MG63细胞较对照组钙盐沉积所导致的矿化结节的形成量明显升高。8)细胞划痕实验检测结果显示：DAI干预MG63细胞12h、24h及36h后细胞迁移能力较对照组均有所下降,且随药物浓度增大,迁移抑制作用增强,80μ M浓度组作用最强。9) Transwell侵袭实验检测结果显示：DAI干预后,MG63细胞的侵袭细胞数较对照组明显减少,且DAI浓度越高发生侵袭的细胞数越少(P<0.01)。10)免疫细胞化学检测结果显示：DAI干预后的MG63细胞中的抑癌基因PTEN蛋白的表达量较对照组升高,而凋亡抑制蛋白Survivin和金属基质蛋白MMP-9的表达均较对照组减少(P<0.01)。结论：1.植物雌激素DAI能有效的抑制人骨肉瘤细胞MG63的增殖并能诱导其凋亡,且呈浓度、时间依赖性,其中80gM浓度组作用明显。2.DAI可上调PPARY表达,下调凋亡抑制蛋白Survivin的表达,上调抑癌基因PTEN的表达,抑制成骨转录因子Runx2的转录活性,下调侵袭转移相关的ECM重塑相关基因蛋白——金属基质蛋白(MMP-9)的表达,抑制MG63细胞侵袭和迁移。3.低浓度DAI可使MG63细胞成骨特异性标志物ALP活性升高、I型胶原蛋白的含量升高并出现钙盐沉积。