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背景和研究目的:多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是生育期妇女常见的内分泌紊乱性疾病,以持续性无排卵和高雄激素的临床表现为特征,其发病机制尚不清楚。近期研究表明,PCOS患者的卵巢中,颗粒细胞存在促凋亡和抗凋亡之间的失衡,并与PCOS的高雄激素密切相关。在前期研究工作中,我们通过差异蛋白质谱分析技术筛选出正常人和PCOS患者卵巢组织中69种差异表达的蛋白,HSP10是该差异表达谱内代表性蛋白之一,在PCOS患者卵巢中表达下调。既往大量的研究表明,HSP10在许多重要组织中均有表达,其功能涉及细胞凋亡、增殖、炎症免疫、生殖等诸多方面。本研究通过外源性高雄激素诱导体外培养的小鼠颗粒细胞发生细胞凋亡,观察高雄激素作用下颗粒细胞HSP10的表达;利用已成功构建的HSP10基因小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)重组腺病毒载体和HSP10基因超表达重组腺病毒载体,实现体外培养的小鼠卵巢颗粒细胞中HSP10的降调节和超表达,从而探讨HSP10在高雄激素诱导颗粒细胞凋亡病理生理机制中的作用。材料与方法: (1)用TUNEL的方法检测和比较PCOS患者和正常人卵巢组织的颗粒细胞凋亡。(2)体外培养小鼠卵巢颗粒细胞,经不同浓度的睾酮(10-8 ~ 10-5 mmol/L)处理,MTT及Flow cytometry方法检测颗粒细胞凋亡,Western Blot方法检测活性Caspase-3表达,Real time-PCR的方法检测HSP10表达。(3)将课题组成功构建的重组腺病毒AdCMV-H1-siRNA/HSP10, AdCMV-HSP10转染AD293细胞进行病毒扩增。用重组腺病毒AdCMV-H1-siRNA/HSP10、AdCMV-HSP10转染小鼠颗粒细胞,提取总蛋白,Western Blot检测HSP10蛋白的表达;MTT方法检测细胞活力,Flow cytometry方法检测细胞周期和细胞凋亡。(4)用AdCMV-H1-siRNA/HSP10重组腺病毒感染培养的小鼠颗粒细胞, Western blot及Real time-PCR的方法检测增殖与凋亡相关的细胞因子:Ki67、ERK、p-ERK、Bcl-2、Bax、caspase9、caspase3表达;用ERK抑制剂PD98059(PD)处理小鼠卵巢颗粒细胞,检测凋亡相关因子p-ERK,Bcl-2,caspase9,caspase3表达;用AdCMV-HSP10重组腺病毒感染小鼠颗粒细胞48h后再用PD处理,同样检测上述凋亡相关因子的表达。结果: (1)与对照组相比,PCOS患者卵巢组织中颗粒细胞凋亡率(apoptosis index)增加,差异有统计学意义(p<0.05)。(2)与对照组相比,10-6M、10-5M睾酮处理组颗粒细胞的细胞活力降低,细胞凋亡增加,活性Caspase-3表达增加;HSP10表达降低(P<0.05)。(3)重组腺病毒AdCMV-H1-siRNA/HSP10感染小鼠颗粒细胞后,HSP10表达水平降低,干涉效率76%(p<0.05)。重组腺病毒AdCMV-HSP10感染后,HSP10表达水平升高2.5倍(p<0.05)。HSP10基因RNA干涉后,细胞活力降低且细胞周期阻滞在G2期,明显抑制了增殖相关因子p-ERK、Ki67的表达,抑制了Bcl-2表达,同时明显促进了促凋亡因子Caspase-9、Caspase-3的表达(p均<0.05)。(4)与对照组相比,50μM PD98059明显抑制了抑凋亡因子p-ERK,Bcl-2的表达,且促进了促凋亡因子Caspase-9,Caspase-3的表达(p<0.05)。与50μM PD98059组相比,HSP10超表达组明显抑制了PD98059对凋亡因子p-ERK,Bcl-2,Caspase-9,Caspase-3的作用(p<0.05)。结论: (1)PCOS患者卵巢颗粒细胞凋亡增加,可能与PCOS高雄激素血症的病理生理过程相关。(2)体外实验中,高雄激素水平导致小鼠颗粒细胞凋亡增加,且HSP10表达降低;HSP10基因被干涉后,颗粒细胞凋亡增加;而HSP10基因超表达后,抑制了颗粒细胞凋亡。因此,HSP10对颗粒细胞具有“保护性”作用,高雄激素水平降低颗粒细胞HSP10的表达,进而促进了颗粒细胞凋亡。(3)高雄激素抑制HSP10进而促进颗粒细胞凋亡,是通过线粒体的凋亡相关信号通路参与。(4)这些结果,增进了我们对PCOS高雄激素血征病理生理机制的认识,尤其是HSP10调节卵巢颗粒细胞凋亡的作用及其分子机制。