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研究目的1.明确MIR22HG在肝癌中的表达情况及与肝癌患者预后的关系;2.明确MIR22HG在肝癌中的生物学功能;3.探讨MIR22HG调控肝癌发展的分子机制。研究内容和方法1.MIR22HG在肝癌中的表达情况及与肝癌患者预后的关系。利用 52-patient cohort、TCGA cohort、GSE14520 及 145-patient cohort 4 个队列明确MIR22HG在肝癌中的表达情况,分析其表达与肝癌患者各临床病理特征及预后的关系;探讨MIR22HG是否为肝癌预后的独立危险因素。2.探讨MIR22HG的生物学功能。通过CCK-8、EdU、裸鼠皮下成瘤的方法检测MIR22HG对肝癌细胞增殖能力的影响;采用transwell、裸鼠肺转移瘤模型等方法检测MIR22HG对肝癌侵袭、转移能力的影响。3.探讨 MIR22HG 与 miR-22-3p 的关系。利用qRT-PCR、生物信息学分析等方法从细胞学、组织学水平探讨MIR22HG与miR-22-3p的关系;通过transwell实验探讨MIR22HG是否通过miR-22-3p发挥作用。4.MIR22HG 通过 miR-22-3p 调控 HMGB1。利用miRanda、PicTar软件预测miR-22-3p的潜在靶基因;利用qRT-PCR、western blot、双荧光素酶报告实验等阐明MIR22HG通过剪切成miR-22-3p调控HMGB1表达;通过体外侵袭、迁移实验证明MIR22HG通过调控HMGB1抑制肝癌细胞侵袭、迁移。5.探讨MIR22HG与HuR的关系。通过RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)、RNA pull down实验证明MIR22HG与HuR结合;用放线菌酮处理细胞后,检测HuR对MIR22HG半衰期的影响;采用RIP、qRT-PCR明确MIR22HG与HuR结合对HuR与靶基因结合能力的影响。结果1.MIR22HG在肝癌中低表达且其低表达与肝癌患者不良预后相关。52-patient cohort、TCGA cohort、GSE14520 及 145-patient cohort 4 个队列均显示MIR22HG在肝癌中低表达,其低表达与肝癌病理分期、门脉癌栓、巴塞罗那分期相关。生存分析显示MIR22HG低表达与肝癌患者不良预后相关,且是肝癌预后不良的独立危险因素。2.MIR22HG抑制肝癌细胞增殖、侵袭、迁移及转移。体内外实验结果显示过表达MIR22HG促进肝癌细胞的增殖,而敲除MIR22HG则抑制肝癌细胞的增殖。体外侵袭、迁移实验显示,过表达MIR22HG能抑制肝癌细胞的侵袭、迁移;敲除MIR22HG促进肝癌细胞的侵袭、迁移。体内实验显示过表达MIR22HG抑制肝癌细胞转移至肺;沉默MIR22HG促进肝癌细胞的肺转移。3.MIR22HG与miR-22-3p呈正相关关系。MIR22HG是miR-22-3p的宿主基因,过表达MIR22HG上调miR-22-3p的表达,而敲除MIR22HG下调miR-22-3p的表达。miR-22-3p在肝癌组织中低表达,其低表达与肝癌患者不良预后相关。体外侵袭及迁移实验显示,miR-22-3p inhibitor能逆转MIR22HG对肝癌细胞侵袭、迁移能力的抑制作用;而miR-22-3p mimic能抑制MIR22HG沉默对肝癌细胞侵袭、迁移能力的促进作用。上述结果提示MIR22HG通过miR-22-3p抑制肝癌细胞的生物学功能。4.MIR22HG 通过 miR-22-3p 调控 HMGB1。通过qRT-PCR、western blot、双荧光素酶报告实验等提示,HMGB1是miR-22-3p的靶基因,MIR22HG通过剪切成miR-22-3p抑制HMGB1的表达。体外侵袭、迁移实验显示,HMGB1能解除miR-22-3p及MIR22HG对肝癌细胞的侵袭、迁移的抑制作用,提示MIR22HG通过miR-22-3p抑制HMGB1的表达,进而抑制肝癌细胞的侵袭、迁移能力。5.MIR22HG与HuR的靶基因竞争性结合HuR。利用RIP、RNA pull down实验证明了 MIR22HG与HuR的直接结合。干扰HuR后加放线菌酮处理,利用qRT-PCR检测MIR22HG的半衰期,结果显示沉默HuR能缩短MIR22HG的半衰期。EdU及transwell实验结果显示HuR能解除MIR22HG对肝癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的抑制作用,提示HuR可能介导了MIR22HG的功能。RIP、qRT-PCR及western blot实验显示,MIR22HG能抑制HuR与其靶基因的结合并下调HuR的靶基因;而敲除MIR22HG,HuR下游靶基因的表达上调。提示MIR22HG与HuR下游靶基因竞争性结合HuR,导致HuR下游靶基因表达下调。结论1.MIR22HG在肝癌组织中显著低表达,其低表达与肝癌患者不良预后相关。2.MIR22HG能抑制肝癌细胞增殖、侵袭、迁移及转移。3.MIR22HG与miR-22-3p呈正相关关系,MIR22HG通过剪切成miR-22-3p抑制肝癌细胞的侵袭、迁移。4.MIR22HG通过miR-22-3p抑制肝癌细胞HMGB1的表达,进而抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及迁移。5.MIR22HG与HuR靶基因竞争性结合HuR,导致HuR靶基因表达下调,从而抑制肝癌细胞增殖、侵袭及迁移。