植物青枯病是由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引发的细菌性萎蔫病害，它严重威胁多种经济粮食作物的产量和品质。青枯菌在全球各大洲温暖湿润的地区均有分布，具有极强的遗传分化性，可在多种寄主植物上引发青枯病，因此统称青枯菌复合种。近年来，随着基因组学技术的迅猛发展，越来越多的代表性青枯菌株系（＞100）完成了基因组测序，为青枯菌的遗传和进化，以及新型致病相关基因功能分析的研究提供了理论支撑。寄主与青枯菌的互作关系主要通过遗传学、分子生物学、发育学、生物化学等进行定性研究，重点研究植物如何通过非特异性和特异性免疫抑制青枯菌的侵染，以及青枯菌如何利用致病因子躲避或抑制植物的防御反应，导致植物发病。大量定性研究为解释青枯菌致病机理提供了坚实的理论基础，但是仅仅只有定性的信息对了解植物为什么或者是否会发病还不够充分，而且对如何采用药剂精准防控也没有指导意义。因此，植物与病原互作的基础理论研究需要对青枯菌在寄主植物体内增长，迁移和消亡，甚至进化进行定量研究，细菌性病害的药剂精准控制需要在理论突破上进一步深化。本研究采用理论和实际相结合的研究方法，系统构建了茄科雷尔氏菌侵染致病动态模型，并验证了药剂调控对模型的影响，以期为植物青枯病的系统控制和精准用药提供理论支撑。　　1一种青枯病表型评估的新方法　　以接种不同青枯菌的番茄作为研究对象，系统地检测了接种后 9 天内，植物病情指数和重量的变化动态，将质量动态数据转换成相对失水量和累计失水量；以寄主植物的生理失水趋势作为主要参数，构建一种可用于青枯病表型评估的新方法。结果表明，植物失水状况在不同处理情况下有明显差异。其中，累计失水量对植物遭受不同处理后的失水状况更为敏感，且与植物发病情况相关性较强，较好地描述青枯病的发展动态。检测青枯菌侵染过程中的重量变化是一种稳定有效的青枯病表型分析方法，植物在发病过程中的失水动态可能成为一种新的植物物理指标，或将应用于植物在生物或非生物胁迫研究中高通量表型分析。　　2青枯菌侵染致病模型的设计和参数定义　　青枯菌在宿主植物的侵染过程可分为五个连续的步骤：1）根部侵染，2）穿越根皮层， 3）增殖，4）表型转变和胞外多糖分泌积累，5）植物发病死亡和病原菌的传播。最初入侵植物体内的病原可以被认为是有效侵染种群。通过一个系统的研究方法对整个侵染过程进行剖析，融合了模型预测和植物侵染实验，在模拟自然条件下来分析病原侵染以及在寄主体内的种群动态。我们从青枯菌侵染循环中提炼出 7 个参数，分别是：1）植物-病原体结合常数（K）；2）最大入侵通量（Vfmax）；3）最大入侵通量衰减率（z）；4）到达木质部的延迟时间（d）；5）木质部中生长速率（μ）；6）群体感应阈值（Q）；7）植物萎蔫对胞外多糖浓度响应的陡度 α。通过模型构建，我们发现有 5 个参数与有效侵染种群大小（Ni）成负相关，也就是随着这些参数值得增加，Ni不断缩小。这些参数分别是：植物-病原体结合常数（K），最大入侵通量衰减率（z），木质部中生长速率（μ），群体感应阈值（Q）和植物萎蔫对胞外多糖浓度响应的陡度。总体而言，有效侵染种群大小（Ni）由病原侵染通量和萎蔫动力学之间的互动权衡来决定的。侵染通量受植物-病原体结合常数（K），最大入侵通量（Vfmax）和最大入侵通量衰减率（z）调控，而萎蔫动力学则受生长速率（μ），群体感应阈值（Q）和植物萎蔫对胞外多糖浓度响应的陡度（α）调控。K和 z降低会导致病原菌有效入侵通量减少，导致有效侵染种群数量的降低。另外，μ，Q和α的上升会延迟病原体内迁移，从而降低后期重复侵染时病原的入侵数量。Ni能显著增加最大入侵通量（Vfmax），而 α 可以代表寄主植物的发病的萎焉速率。　　3青枯菌的侵染致病动态模型构建　　3.1青枯菌重复侵染分析及验证　　采用野生型模式青枯菌GMI1000株系及其耐庆大霉素GRS540衍生型株系对番茄植株进行顺序接种实验。先接种GMI1000株系，1、8、23和48小时后（hpi），再接种GRS540耐性株系，并在第一次接种 5天后（dpi），检测 GRS540对植株的侵染情况。结果显示，当二次侵染发生在23 hpi时，仍然有＞60%的植物被GRS540侵染，而当二次侵染发生在48 hpi时，只有极少数的植株中可以检测到 GRS540菌株。因此，青枯菌的重复侵染可在接种后 48小时内持续发生，重复侵染的衰减率为2 ± 0.1 % h-1。　　3.2青枯菌侵染致病动态模型参数测定　　采用 Reed和 Muench的方法来计算青枯菌的侵染中量（MID），并用 MID来表示青枯菌的侵染力。结果表明，在灌根接种后 10 天内，MID 的值逐渐降低，并稳定在 5.9 106 cfu?mL-1。为了进一步明确 MID 在植物根部侵染的特性，我们采用茎部注射接种的方法来评估青枯菌的侵染力，结果显示茎部注射5天后的MID仅为4.1×103 cfu?mL-1。　　通过检测灌根接种后植物体内的含菌量变化，计算青枯菌在木质部内的生长速率。结果表明，青枯菌在体内的消长动态可分为初始期、对数期、稳定期和衰减期。对数期发生在接种后2到5天，拟合结果得出青枯菌在木质部内的生长速率为0.196 h-1± 0.039，但是拟合相关系数较低，这可能与青枯菌在不同植株上发生首次有效侵染的时间差异有关。随后，我们分别采用茎部直接注射接种和液体培养基实验计算对数期的生长速率，它们分别为0.233 ± 0.012 h-1和0.253 ± 0.034 h-1，这两个值均具有较高的拟合相关系数。综上，可以推断青枯菌在木质部的生长速率接近0.25 h-1。　　检测植物体内带菌量，并记录每株植物的病情指数，研究发病情况和带菌量之间的关系。马修斯相关性（MCC）分析结果表明，诱导植物发病时的植物体内带菌量的最佳预测阈值为6×107± 0.97×107cfu?g-1，马修斯相关系数高达0.896，说明该预测阈值十分可靠。　　通过对 500 多株番茄在接种青枯菌后首次出现萎蔫后的病情动态进行拟合，分析植物萎蔫对胞外多糖积累的响应陡度α，其嵌合萎蔫时间响应曲线的陡度为0.612 ± 0.012，再结合胞外多糖分泌量，体内带菌量和生长速率，最终计算得到萎蔫程度对胞外多糖积累的响应系数为 2.31。进一步分析衰减期植物体内青枯菌的复制衰减速率 μ-，拟合结果显示该复制衰减速为0.25 h-1。　　3.3青枯菌的侵染致病动态模型构建及验证　　青枯菌侵染动态模型的主要参数分别为K = 5.9×106，z = 0.02，μ = 0.23，q = 6×107，α=2.31，b = 0.612和μ-= 0.25，将这些参数导入模型，构建青枯菌的侵染致病动态模型，并计算青枯菌在侵染过程中的瓶颈大小，通过比较有效侵染种群数量的预测值和实验值，验证模型的可信度。结果表明，最大入侵通量Vfmax为5~22 cells?h-1，当青枯菌的接种量为5×107 cell?mL-1，根据模型推测接种 7天后，Ni应为 90~476。通过大量试验得到 Ni的中位数为 458，其两倍标准偏差为 2734（2sd）。Ni的高度差异性可能是来源于生物学差异，也可能是试验中对 GRS540随机抽样过程中的固有差异。为进一步分析实验设计对 Ni差异的影响，我们根据实验过程中的参数如样本量和接种液中 GRS540/GMI1000的比例，并固定 Ni为 458，采用随机抽样对侵染过程进行模拟，预测在试验过程中Ni的理论值，结果显示Ni的预测值中位数为454（2sd =507）。因此该实验过程中的差异有18%来自于随机抽样过程中的固有差异，并进一步推断青枯菌的初期侵染是一个随机的过程。　　4青枯菌侵染寄主的瓶颈效应分析　　采用伤根接种与灌根接种，分析根部物理屏障对有效侵染种群数量的影响；采用青枯菌三型分泌系统，胞外多糖分泌和六型分泌系统功能缺失的突变体，分别评估它们在正常灌根接种和伤根接种下的有效侵染种群的数量，研究青枯菌的致病因子对侵染瓶颈效应的影响；通过不同温度（27℃和30℃）处理，研究高温对青枯病侵染、定殖和发病的影响。结果表明，伤根接种 4 天后，所有试验植株菌发生较大程度的萎蔫，说明消除物理屏障后，可加速病原的侵染和定殖，最终导致青枯病的迅速发生。通过上述复合侵染的方法，对 Ni评估，结果表明在伤根情况下 Ni的中位数为急剧增加至 24215。三型分泌系统突变体的在灌根接种后， Ni显著低于野生型，其中位数为6，均值为7 ± 4，较野生型降低了70倍；在伤根接种后，Ni显著同样低于野生型，其中位数为53，均值为62 ± 40，较野生型降低了482倍。对胞外多糖和六型分泌的突变体来说，在灌根接种时与野生型相比分别降低了 22和 19倍，其中位数分别为 21和 24；在伤根接种时与野生型相比分别降低了 82和 6倍，中位数分别为 296和3998。三型和六型分泌系统突变体在定殖过程中的生长速率明显降低，分别为0.112 ±0.005 h-1和0.201 ± 0.017 h-1；而胞外多糖突变体在植物体内的增长速率与野生型相比无显著性差异，为0.225 ± 0.006 h-1。高温影响初期侵染，其有效侵染种群数量较27℃时降低了4倍，中位数为114；在植物体内的生长速率明显高于常规温度，高温时的生长速率为0.333 ± 0.014；高温下的发病情况也显著高于 27℃ 的发病情况。为了检验该研究方法是否具有普遍适用性，我们在另一个研究系统（苜蓿-青枯菌体外侵染系统）对野生型青枯菌的瓶颈效应进行评估，试验得出青枯菌有效侵染种群数量的中位数为289，并与模型预测结果无显著性差异。　　5多基因对青枯菌致病力的影响　　为了进一步验证青枯菌侵染致病动态模型，我们通过叠加基因敲除技术，系统研究了三型分泌系统效应蛋白（T3Es）基因对青枯菌的致病过程的影响。结果表明，青枯菌的三个ripH基因在番茄植株的致病过程中，出现一定程度的功能冗余。与野生型青枯菌GMI1000相比，三基因突变体 GRS522 的致病力显著降低。侵染动态学研究表明，GRS522 侵染有明显延迟，其侵染力也显著减弱；一旦其进入寄主体内， GRS522 在寄主体内的分布情况与GMI1000 无显著性差异。在 GRS522 的基础上，通过基因敲除获得 RipA2，RipR，RipAA和RipD三型效应蛋白叠加突变体，它们分别是(GRS522-RipA2)、MEME3 (MEM1-RipR)、MEM33 (MEM3-RipAA)和MEM38 (MEM33-RipD)。与野生型GMI1000相比，所有突变体导致萎蔫的时间均有延迟，并且其致病力显著降低。存活性分析结果表明，突变体之间致病力没有显著差异；其中MEM1的致病力高于其他突变体，但与GRS522相比，无显著性差异。　　6药剂调控对青枯菌侵染动态模型的影响及模型验证　　以防治青枯病常用的药剂（噻菌铜、农用硫酸链霉素、荧光假单胞杆菌、枯草芽孢杆菌）为研究对象，探究药剂调控对青枯菌侵染动态模型的影响。结果表明，四种药剂处理后，番茄青枯病发生程度降低，其中噻菌铜对青枯病的控制效果最佳；农用链霉素对青枯菌运动性的抑制作用最优；此外，农用链霉素、荧光假单胞杆菌和枯草芽孢杆菌处理后，青枯菌在土壤中的定殖能力均显著下降，而噻菌铜对青枯菌在土壤中的定殖能力无影响。基于噻菌铜对番茄青枯菌防控效果最优，系统评价了噻菌铜对青枯菌在寄主体内生长速率和有效侵染种群数量的影响，结果表明，噻菌铜处理与对照的生长速率分别为0.1876 ± 0.026 h-1和0.194± 0.042 h-1，不存在显著性差异；噻菌铜灌根处理后，青枯菌有效侵染种群数量由476下降到227，差异显著；通过模型预测，噻菌铜处理的青枯菌有效侵染种群数量为 208，与实测值相似，表明模型适用于预测药剂调控对青枯病发生的影响。　　综上所述，在模拟自然环境下，青枯菌侵染致病的定量研究是重要的科学问题。本论文从青枯菌的早期侵染，木质部的定殖，地上部分的迁移到杀死植物的各个过程进行了详细描述，构建了青枯菌侵染致病的动态模型，明确了青枯菌侵染的复杂性，阐明了青枯菌的有效侵染种群数量以及如何在寄主体内复制、迁移。系统分析了根部物理屏障、致病因子和高温对青枯菌侵染的瓶颈效应，进一步明确了青枯菌侵染动态的关键因子。最后，评价了多基因和药剂调控对青枯菌侵染动态模型的影响，进一步验证了模型的可行性，为青枯菌的侵染致病动态和瓶颈效应提供一个较为系统全面的认识，从而更好地解释寄主与病原的互作机理。同时，评估了药剂影响下青枯菌侵染动态模型的特征，明确了模型适用于预测药剂调控对青枯病发生的影响，这对于青枯病的系统控制和精准用药具有重要的意义。