研究背景与目的结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一,据报道全球每年CRC新发病例高达136万,死亡病例约达69万,严重危害人类健康。寻找结直肠癌发生发展的关键分子及其相互关系,进一步阐明结直肠癌的发病机制具有重要的意义。结直肠癌发病随着年龄的增长,发病风险增加。近年研究发现细胞衰老可能影响周围微环境促进肿瘤的发生。该微环境是由成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞和肿瘤周围的细胞外基质等共同构成的复杂网络。Klotho是由Kuro-o等在1997年发现的一种衰老相关多功能蛋白,其在生物整体抗衰老和延长寿命方面的作用广受关注。Klotho基因表达下降与寿命缩短、动脉硬化、心脑血管等疾病的发生相关。近年来人们发现在一些肿瘤组织中也存在Klotho低表达现象,提示Klotho基因可能参与肿瘤调控。我们前期利用基因芯片筛选,发现Klotho基因受到表观遗传调控,在结肠癌细胞中低表达与启动子DNA高甲基化有关。本研究将进一步阐明Klotho在结直肠癌发生发展中的临床价值和重要生物学功能,探讨Klotho对间质细胞衰老和衰老相关分泌表型的表达调控和作用机制。研究内容和方法1、Klotho在结直肠癌组织中的表达及意义:通过收集143例结直肠癌患者的组织标本,分析Klotho在结直肠癌和癌旁组织中的蛋白表达水平差异及其与患者临床病理参数和生存预后之间的相关性,明确Klotho在结直肠癌发生发展中的临床意义。2、Klotho对细胞衰老和结肠癌细胞生物学行为的影响:应用重组Klotho蛋白处理不同间质细胞(成纤维细胞和血管内皮细胞),检测SA-β-gal染色及衰老标志分子,观察Klotho对细胞衰老的影响。通过系列体内外试验,利用Klotho预处理不同间质细胞后,收集条件培养基与结肠癌细胞共培养;或在结肠癌细胞中过表达Klotho,探讨Klotho对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭及其裸鼠成瘤能力的影响。3、Klotho对衰老相关分泌表型CCL-2表达的影响与生物学作用:通过建立批量衰老相关分泌表型分子筛选和验证。利用细胞体外和动物体内实验探索关键衰老相关分泌表型因子CCL-2对结肠癌细胞生物学行为的影响。4、Klotho通过NF-κB信号通路抑制CCL-2分泌:在间质细胞中,应用重组Klotho蛋白或NF-κB特异性拮抗剂处理,或在结肠癌细胞中过表达Klotho,通过免疫印迹法检测NF-κB信号通路中相关分子的表达变化,酶联免疫吸附试验检测CCL-2的分泌情况,探讨Klotho对NF-κB和CCL-2的调控机制。研究结果1、Klotho在结直肠癌组织中低表达并与患者预后差相关免疫组化分析发现,较癌旁配对非肿瘤组织,Klotho在结直肠癌组织中表达明显降低,其表达水平与患者年龄、淋巴结转移、远处转移和TNM分期显著相关(n=143,P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析发现,结直肠癌组织中Klotho高表达的患者预后较好。多因素COX回归分析发现Klotho高表达是患者生存时间长的独立预测因子(P<0.05)。2、Klotho抑制间质细胞衰老和结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭(1)Klotho对间质细胞衰老的影响。SA-β-gal染色及衰老标志分子的检测发现人重组Klotho蛋白预处理间质细胞,可以减少细胞衰老。(2)Klotho通过抑制间质细胞衰老对结肠癌细胞生物学行为的影响①CCK-8细胞增殖实验和克隆形成实验,发现结肠癌细胞经过衰老细胞的条件培养基培养后,其生长速度明显加快,而外源Klotho预处理则明显抑制结肠癌细胞生长。②Transwell试验表明结肠癌细胞经过衰老细胞的条件培养基趋化后,其迁移和侵袭能力显著增强,而外源Klotho预处理可减弱结肠癌细胞迁移和侵袭能力。③结肠癌皮下移植瘤模型,发现结肠癌细胞与衰老细胞混合注射组裸鼠肿瘤体积和重量明显大于年轻细胞组,而Klotho预处理组裸鼠肿瘤的体积和重量最小。(3)过表达Klotho抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭①CCK-8细胞增殖实验,发现过表达Klotho显著抑制结肠癌细胞的增殖。②Transwell试验表明过表达Klotho能够显著抑制结肠癌细胞的迁移、侵袭能力。③结肠癌皮下移植瘤模型,发现过表达Klotho后裸鼠瘤体的生长较对照组明显减慢。3、Klotho可抑制SASP分子CCL-2的表达及其促结肠癌生长、迁移、侵袭作用(1)间质细胞诱导衰老后,CCL-2的mRNA表达和蛋白的分泌明显升高,而Klotho蛋白的预处理则显著下调CCL-2。(2)CCL-2具有促进结肠癌细胞增殖、迁移作用①CCK-8细胞增殖实验发现CCL-2蛋白共培养可促进结肠癌细胞增殖,特异性受体CCR2拮抗剂可阻断该作用。②Transwell试验表明CCL-2显著促进结肠癌细胞的迁移能力,而特异性受体CCR2拮抗剂可阻断该作用。③结肠癌皮下移植瘤模型,发现瘤周注射CCL-2分子后裸鼠瘤体的生长较对照组明显增快,而同时注射CCR2特异性拮抗剂后可抑制肿瘤生长。4、Klotho通过NF-κB信号通路抑制CCL-2分泌(1)衰老成纤维细胞中NF-κB信号通路活化,人重组Klotho蛋白和NF-κB特异性拮抗剂可以抑制其活化。(2)荧光定量PCR和ELISA法检测发现NF-κB特异性拮抗剂或Klotho处理后,细胞CCL-2的mRNA和蛋白表达均显著下调。(3)在结肠癌细胞中过表达Klotho后NF-κB信号通路被抑制,CCL-2的mRNA表达及蛋白分泌明显减少。研究结论1、在结直肠癌组织中Klotho普遍低表达,其表达水平与患者的年龄,肿瘤的淋巴结转移、远处转移、TNM分期和患者的生存预后相关。Klotho高表达是结直肠癌患者生存预后良好的一个独立预测因素。2、Klotho可以直接抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,还可以通过调控间质细胞的衰老影响结肠癌细胞生存的微环境,进而抑制癌细胞的上述生物学行为。3、Klotho可以抑制衰老细胞SASP分子CCL-2的表达和分泌,CCL-2可以促进结肠癌细胞的增殖和迁移,而CCR2拮抗剂可阻断该生物学作用。4、间质细胞和结肠癌细胞中Klotho可通过NF-κB信号通路抑制CCL-2分泌。