【摘 要】
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本实验为了构建牛乳腺炎粪肠球菌溶血素CylA基因突变株及探索溶血素抗原性,以Genbank上公布的粪肠球菌CylA基因序列为模板（序列号为AY032999.1）,分别设计上、下游同源臂序列扩增引物。经过PCR获得CylA基因上游同源臂序列X及CylA基因下游同源臂序列Y,将CylA基因中间序列替换为p ACYC184质粒中的氯霉素抗性基因Chl,降低实验菌株对氯霉素的敏感程度以便使用抗生素抗性筛选
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本实验为了构建牛乳腺炎粪肠球菌溶血素CylA基因突变株及探索溶血素抗原性,以Genbank上公布的粪肠球菌CylA基因序列为模板（序列号为AY032999.1）,分别设计上、下游同源臂序列扩增引物。经过PCR获得CylA基因上游同源臂序列X及CylA基因下游同源臂序列Y,将CylA基因中间序列替换为p ACYC184质粒中的氯霉素抗性基因Chl,降低实验菌株对氯霉素的敏感程度以便使用抗生素抗性筛选。将X、Chl及Y序列依次连接并转入温敏型自杀质粒p SET4S中,构建粪肠球菌CylA基因缺失重组质粒p SET4S-X-Chl-Y。将该重组质粒电转至粪肠球菌溶血阳性菌株,经过多次细菌传代,通过抗生素抗性筛选出粪肠球菌溶血素CylA基因突变株。同时克隆粪肠球菌溶血素CylA基因进行原核表达,探索其免疫原性。经PCR及单双酶切鉴定结果显示,CylA基因缺失重组质粒成功构建。经PCR及溶血表型鉴定,结果表明成功获得粪肠球菌溶血素CylA基因突变株,为粪肠球菌CylA基因对于溶血素的致病机制及免疫机制研究奠定了研究基础。CylA基因克隆、测序结果显示,成功克隆出1 239 bp的目的DNA条带。构建的p ET-30a-CylA重组质粒使用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳鉴定,结果显示表达的编码蛋白相对分子质量为37 k D,经镍耦合亲和层析柱纯化后获得的蛋白含量为1.5 mg/m L。利用该表达抗原与弗氏佐剂乳化,免疫家兔后经ELISA抗体滴度检测,结果显示在首免以后的第28 d抗滴度达到1:5 000,显示了其抗原性,为进一步研发奶牛乳腺炎基因工程疫苗提供了候选亚单位抗原。
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