人BAFF基因的克隆、表达及抗体制备

来源 :中国协和医科大学 北京协和医学院 中国医学科学院 清华大学医学部 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qiqi251305430
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B淋巴细胞刺激因子(B cell activating factor belonging to the TNF family,BAFF)是1999年新发现的一个细胞因子,属于肿瘤坏死因子超家族成员。人BAFF(hBAFF)属Ⅱ型跨膜糖蛋白,全长285个氨基酸,主要表达于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞表面。BAFF有三种受体:TACI、BCMA和BAFF-R。Moore等人研究发现,BAFF受体仅表达于B细胞和B细胞起源的细胞系上。实验表明,BAFF与B淋巴细胞的活化、增殖、抗体产生、免疫球蛋白类别转换等有关。现已发现,BAFF信号异常可能与多种自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征等相关,也与肿瘤如多发性骨髓瘤、慢性B淋巴细胞性白血病等相关。对hBAFF的深入研究将会成为研究人类自身免疫性疾病以及B细胞系肿瘤发病机理的新热点,而阻断BAFF发挥生物学作用的单克隆抗体具有潜在的临床应用价值。本研究利用RT-PCR的方法从人外周血单个核细胞扩增得到BAFF胞外区83—285氨基酸(hsBAFF83-285)的编码基因,与原核表达载体pET-30a(+)进行连接,在BL21(DE3)中重组蛋白得到了大量表达,主要以包涵体形式存在于沉淀中。我们将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术,用甲基纤维素半固体培养基培养杂交瘤细胞,制备了单克隆抗体。通过免疫双向扩散、间接ELISA、Western blot和流式细胞技术鉴定了抗体的特性。同时,我们从人外周血单个核细胞cDNA中扩增得到可溶形式BAFF(hsBAFF)的编码基因,将其克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中。优化各种诱导表达条件后,得到了重组蛋白的可溶形式表达。通过扩大培养,利用GST亲和柱纯化裂解上清中可溶形式蛋白,并将纯化后蛋白免疫新西兰兔制备了抗hsBAFF的兔多抗血清。ELISA、Western blot鉴定了该多抗血清能与GST-hsBAFF重组蛋白发生特异性反应。本研究所制备的抗hBAFF单克隆抗体和多克隆抗体可以为BAFF的基础与临床研究提供有力的工具,为深入研究BAFF与人类自身免疫性疾病和B细胞系肿瘤的关系,探讨针对BAFF的自身免疫性疾病的检测新方法和治疗新途径奠定了基础。
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