论文部分内容阅读
B淋巴细胞刺激因子（B cell activating factor belonging to the TNF family，BAFF）是1999年新发现的一个细胞因子，属于肿瘤坏死因子超家族成员。人BAFF（hBAFF）属Ⅱ型跨膜糖蛋白，全长285个氨基酸，主要表达于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞表面。BAFF有三种受体：TACI、BCMA和BAFF-R。Moore等人研究发现，BAFF受体仅表达于B细胞和B细胞起源的细胞系上。实验表明，BAFF与B淋巴细胞的活化、增殖、抗体产生、免疫球蛋白类别转换等有关。现已发现，BAFF信号异常可能与多种自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征等相关，也与肿瘤如多发性骨髓瘤、慢性B淋巴细胞性白血病等相关。对hBAFF的深入研究将会成为研究人类自身免疫性疾病以及B细胞系肿瘤发病机理的新热点，而阻断BAFF发挥生物学作用的单克隆抗体具有潜在的临床应用价值。本研究利用RT-PCR的方法从人外周血单个核细胞扩增得到BAFF胞外区83—285氨基酸(hsBAFF83-285)的编码基因，与原核表达载体pET-30a（+）进行连接，在BL21（DE3）中重组蛋白得到了大量表达，主要以包涵体形式存在于沉淀中。我们将纯化的重组蛋白免疫BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术，用甲基纤维素半固体培养基培养杂交瘤细胞，制备了单克隆抗体。通过免疫双向扩散、间接ELISA、Western blot和流式细胞技术鉴定了抗体的特性。同时，我们从人外周血单个核细胞cDNA中扩增得到可溶形式BAFF（hsBAFF）的编码基因，将其克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中。优化各种诱导表达条件后，得到了重组蛋白的可溶形式表达。通过扩大培养，利用GST亲和柱纯化裂解上清中可溶形式蛋白，并将纯化后蛋白免疫新西兰兔制备了抗hsBAFF的兔多抗血清。ELISA、Western blot鉴定了该多抗血清能与GST-hsBAFF重组蛋白发生特异性反应。本研究所制备的抗hBAFF单克隆抗体和多克隆抗体可以为BAFF的基础与临床研究提供有力的工具，为深入研究BAFF与人类自身免疫性疾病和B细胞系肿瘤的关系，探讨针对BAFF的自身免疫性疾病的检测新方法和治疗新途径奠定了基础。