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目的:制备负载人肝癌相关抗原SMP30和HSP70L1的DC,探讨其诱生的CTL的体外抗肝癌作用。方法:(1)用基因重组技术将SMP30、HSP70L1基因连接到慢病毒载体上,构建SMP30、HSP70L1双基因(SMP30-HSP70L1)重组慢病毒、SMP30重组慢病毒、HSP70L1重组慢病毒,用荧光稀释法对其进行滴度复检。(2)Ficoll梯度密度离心法从HLA-A2阳性健康成人外周血分离单个核细胞,细胞因子GM-CSF和IL-4诱导生成DC,用流式细胞术鉴定。(3)共分为6个组实验:分别用SMP30-HSP70L1重组慢病毒、SMP30重组慢病毒、HSP70L1重组慢病毒、空载慢病毒转染DC和肝癌组织总蛋白(经验证含SMP30、HSP70L1蛋白)致敏DC作为实验组,单纯DC作为空白对照组,即:SMP30-HSP70L1组、SMP30组、HSP70L1组、空载慢病毒组、肝癌组织总蛋白组、空白对照组。(4)对各组DC进行检测:Western blot检测SMP30蛋白和HSP70L1蛋白的表达情况,DC的表面免疫分子CD80和CD86的表达情况用流式细胞术来检测,ELISA检测各组DC细胞因子IL-1、IL-12和IFN-γ的分泌量。(5)用人CD3+T细胞磁珠分选试剂盒分离得到自体T淋巴细胞,流式细胞术检测其纯度。将T淋巴细胞与上述各组DC共培养诱导生成CTL。ELISA检测各组CTL细胞因子IFN、TNF的分泌量。CCK8检测各组CTL的增殖状况。(6)将各组CTL与人肝癌细胞SMMC7721共培养,用流式细胞术检测各组CTL的体外抗肝癌作用。结果:(1)SMP30 与 HSP70L1 融合(SMP30-HSP70L1)重组慢病毒、SMP30重组慢病毒、HSP70L1重组慢病毒构建成功,滴度复检的结果显示病毒滴度约为3×108TU/ml。(2)成功诱导培养人外周血DC,用重组慢病毒转染DC后,WB结果显示:SMP30-HSP70L1组和SMP30组DC的SMP30蛋白表达水平明显高于其他组DC,SMP30-HSP70L1组和HSP70L1组DC的HSP70L1蛋白的表达水平高于其他组DC,P<0.05,差异有统计学意义;流式细胞术结果显示SMP30-HSP70L1组DC的CD86表达率高于HSP70L1组、空载慢病毒组和空白对照组DC(P<0.05),与肝癌组织总蛋白组DC之间没有统计学差异;各实验组DC间的表面免疫分子CD80的表达率没有统计学差异;ELISA结果显示:SMP30-HSP70L1组DC分泌细胞因子IL-1的量高于SMP30组、HSP70L1组、空载慢病毒组和空白对照组(P<0.05),与肝癌组织总蛋白组DC无统计学差异;SMP30-HSP70L1组DC细胞因子IL-12和IFN-γ的分泌量高于HSP70L1组、空载慢病毒组和空白对照组DC(P<0.05),与肝癌组织总蛋白组、SMP30组DC之间不存在统计学差异。(3)流式实验结果显示:通过免疫磁珠法筛选得到的T淋巴细胞的纯度为 93.1%;SMP30-HSP70L1 组 DC 诱生的 CTL 分泌的 TNF-α、IL-12 除了与肝癌组织总蛋白组无统计学差异外,均高于其他各组(P<0.05);SMP30-HSP70L1组DC诱生的CTL分泌的IFN-α、IFN-y高于空白对照组和空载慢病毒组(P<0.05),与另外3组无统计学差异;CCK8细胞增殖检测实验的结果发现SMP30-HSP70L1组高于空白对照组、空载慢病毒组、70慢病毒组和30慢病毒组(P<0.05),与肝癌组织总蛋白组无统计学差异。(4)流式检测CTL的杀伤作用,结果为:①当效靶比(E/T)=15:1时,SMP30-HSP70L1组DC诱生的CTL对肝癌细胞SMMC7721的杀伤率(14.50±0.33)%高于SMP30组、HSP70L1组、空载慢病毒组以及空白对照组(P<0.05),与肝癌组织总蛋白组(14.25±0.64)%之间没有统计学差别;②当效靶比(E/T)=30:1时,SMP30-HSP70L1组DC诱生的CTL对肝癌细胞SMMC7721的杀伤率(50.53±0.2)%高于空载慢病毒组、HSP70L1组和空白对照组(P<0.05),与肝癌组织总蛋白组(50.38±0.48)%、SMP30组(46.42±2.14)%之间没有统计学差别。结论:除了肝癌组织总蛋白组外,与SMP30重组慢病毒、HSP70L1重组慢病毒、空载慢病毒转染DC各实验组相比,人肝癌相关抗原SMP30和HSP70L1共同修饰DC,能对DC的成熟产生更好促进作用,更有效地刺激T淋巴细胞的增殖与活化,效靶比为15:1时,CTL在体外能更好地杀伤肝癌细胞SMMC7721。