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背景:胶质瘤是脑和其他中枢神经系统中最具侵袭性和最普遍的原发性恶性肿瘤,同时具有发病率高、复发率高、恶性程度高、侵袭性高、治疗难度大、临床预后差以及死亡率高等特点。替莫唑胺是一种用于治疗胶质瘤患者的一线化疗药物,通过对胶质瘤细胞DNA进行烷基化修饰,发挥抑制胶质瘤细胞增殖和诱导其凋亡的作用,对于改善脑胶质瘤患者的预后具有重要作用。但有许多胶质瘤患者对替莫唑胺具有先天性或获得性的耐药作用,是造成胶质瘤患者中替莫唑胺治疗失败的原因之一,显著缩短了胶质瘤患者的PFS和OS,所以目前迫切需要开发针对替莫唑胺耐药的脑胶质瘤患者的治疗策略。MGMT能够修复替莫唑胺治疗引起的DNA损伤,所以MGMT的表达是胶质瘤对替莫唑胺产生耐药性的主要原因之一。绿原酸是一种植物中提取的活性多酚类物质,对多种肿瘤类型具有抗肿瘤活性,不仅可逆转多药耐药淋巴瘤的耐药,还可增强骨肉瘤中阿霉素的细胞毒性作用。但其针对胶质瘤的直接抗肿瘤作用及是否改善化疗敏感性尚无相关报道。因此,进一步探索绿原酸对胶质瘤的作用及机制、关键的调控分子/蛋白,有望为脑胶质瘤的发生机制及全新的治疗策略奠定基础。目的:本研究拟探索绿原酸对胶质瘤细胞是否存在直接治疗作用,进一步探索绿原酸是否与替莫唑胺治疗存在协同作用,并提出了绿原酸可能通过调控MGMT表达进而增强胶质瘤细胞对替莫唑胺的化疗敏感性的全新假设,深入研究其涉及的关键通路和蛋白分子。方法:在本研究中,运用生物信息学分析MGMT在胶质瘤中的综合作用。通过CCK-8测定法评估绿原酸对胶质瘤细胞活力的影响。通过细胞集落形成实验评估绿原酸对胶质瘤细胞增殖的影响。通过细胞划痕实验和Transwell实验评估绿原酸对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响。通过流式细胞术检测方法分析绿原酸对胶质瘤细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响。通过RT-q PCR方法分析胶质瘤细胞中MGMT转录水平的变化。通过细胞转染方法来研究MGMT和β-catenin在绿原酸诱导胶质瘤细胞凋亡及提高胶质瘤细胞对替莫唑胺的化疗敏感性的作用。通过Western Blot检测胶质瘤细胞及人胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型组织中相关蛋白分子的表达水平变化。通过免疫组织化学染色法观察胶质瘤移植瘤组织中相关蛋白分子的表达水平的变化。通过建立人胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型来验证绿原酸在体内实验中的作用。结果:1、生物信息学分析结果发现MGMT高表达与胶质瘤患者预后的不良相关,并且存在多个与MGMT相关性较高的影响胶质瘤治疗的通路值得研究。2、CCK-8测定法结果表明绿原酸能够有效降低胶质瘤细胞活性,而对正常细胞活性影响较小。细胞集落形成实验结果表明绿原酸能够抑制胶质瘤细胞增殖。Transwell实验和细胞划痕实验结果表明绿原酸能够抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭。流式细胞术检测结果表明绿原酸能够诱导胶质瘤细胞周期阻滞和细胞凋亡。Western Blot结果表明在绿原酸的作用下,胶质瘤细胞中Cleaved PARP-1,Cleaved Caspase-3以及Bax蛋白表达增加,而Cyclin B1和Bcl-2蛋白表达减少。3、RT-q PCR和Western Blot结果表明绿原酸能够降低胶质瘤细胞中MGMT的转录和表达水平,且呈浓度和时间依赖性。同时,联合应用绿原酸和替莫唑胺具有协同抗胶质瘤细胞的作用。在胶质瘤细胞中过表达(Overexpression,简称OE)MGMT能够逆转绿原酸和替莫唑胺的协同抗胶质瘤细胞的作用。在胶质瘤细胞中基因沉默β-catenin能够抑制MGMT转录和表达,并且增强胶质瘤细胞对替莫唑胺的化疗敏感性。4、在胶质瘤细胞中,绿原酸能够抑制p-GSK-3β和β-catenin蛋白的表达,下调MGMT表达水平,降低细胞增殖活性,诱导胶质瘤细胞凋亡以及增强胶质瘤细胞对替莫唑胺的化疗敏感性的作用。GSK-3β抑制剂(CHIR-99021)或OE-β-catenin均能够逆转绿原酸的上述作用。5、在胶质瘤细胞中,绿原酸能够上调PTEN蛋白的表达,在胶质瘤细胞中抑制p-AKT,p-GSK-3β,β-catenin和MGMT蛋白的表达,降低细胞增殖活性,诱导胶质瘤细胞凋亡以及增强胶质瘤细胞对替莫唑胺的化疗敏感性。PTEN抑制剂(SF1670)能够逆转绿原酸的上述作用。6、在人胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型体内实验中,绿原酸能够抑制胶质瘤生长,降低p-AKT,p-GSK-3β,β-catenin和MGMT蛋白的表达。相比于绿原酸或替莫唑胺单独用药,联合应用绿原酸和替莫唑胺能够明显减少荷瘤裸鼠的肿瘤体积。结论:1、绿原酸在体内和体外实验中均表现出抑制胶质瘤细胞增殖活力,增强胶质瘤细胞对替莫唑胺的化疗敏感性。2、绿原酸通过降低胶质瘤细胞中MGMT的转录和表达水平增强胶质瘤细胞对替莫唑胺的化疗敏感性。3、绿原酸通过抑制Wnt/β-catenin通路对MGMT的转录和表达水平进行调控。4、绿原酸通过上调PTEN抑制PI3K/AKT通路,进一步对Wnt/β-catenin通路进行调控。