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背景:奶牛乳腺炎是严重危害奶牛养殖业的疾病之一,同时对乳制品和人类公共卫生安全造成了严重的威胁。在引起奶牛乳腺炎的致病菌中,金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和表皮葡萄球菌是几种重要的病原菌。对奶牛乳腺炎主要致病菌进行快速检测是实现早期诊断和治疗的重要保证,而传统的病原体检测方法存在操作繁琐、耗时、需要复杂的仪器及专业人员检测等问题,不适用于现场快速检测。因此,迫切需要开发一种快速、准确的奶牛乳腺炎主要致病菌快速检测方法。本研究拟建立金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和表皮葡萄球菌三种病原菌的环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）,以期为奶牛乳腺炎病原菌的快速检测提供技术支撑。目的与方法:本研究分别以金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌fecA基因和表皮葡萄球菌SesB基因为检测靶基因,首先,对设计的多组LAMP引物进行筛选,并对反应中Mg2+、甜菜碱、dNTPs、时间、温度等因素进行优化。然后,对建立的LAMP检测方法的特异性和敏感性进行评价。最后,应用建立的可视化LAMP检测方法分别对奶牛乳样临床样本进行检测,取得研究结果如下:1.以金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌fecA基因和表皮葡萄球菌SesB基因为靶基因,采用LAMP引物设计软件Primer Explorer V5,根据靶基因高度保守序列设计多组LAMP引物进行引物筛选,筛选出扩增效果最佳的nuc-1、fecA-2、SesB-4引物用于后续试验。2.通过对LAMP反应体系（Mg2+、甜菜碱、dNTPs浓度）和反应条件（温度、时间）进行优化,成功建立了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和表皮葡萄球菌LAMP检测体系。然后,以钙黄绿素为显色指示剂,建立了可视化LAMP检测方法。随后,分别以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和表皮葡萄球菌为阳性对照,以其他十几种常见菌株为阴性对照进行特异性试验。结果表明,所建立的三种致病菌LAMP检测方法能够特异识别目标菌株,而不与其他菌株发生交叉反应,表明建立的LAMP方法特异性良好。用微量分光光度计测量目标菌株标准质粒浓度,将菌株标准质粒进行倍比稀释分别进行LAMP及PCR检测,比较两种方法的敏感性。结果显示,所建立的金黄色葡萄球菌LAMP检测方法的最低检测限为2.7×101 copies/μL,大肠杆菌和表皮葡萄球菌LAMP检测方法最低检测限为5× 101 copies/μL,建立的LAMP法均比PCR方法敏感100倍。3.应用建立的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和表皮葡萄球菌LAMP检测方法分别对210份奶牛乳样临床样本进行检测,并与PCR检测结果进行比较分析。结果显示,LAMP法对金黄色葡萄球菌的检出率为29.5%,常规PCR方法检出率为23.3%;LAMP法对大肠杆菌的检出率为33.3%,而PCR法检出率为20.5%;LAMP法对表皮葡萄球菌的检出率为12.4%,常规PCR法的检出率为1 1%,表明建立LAMP检测方法对三种致病菌的检出率均高于常规PCR方法。结论:本研究建立了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和表皮葡萄球菌LAMP检测方法,该方法易于操作、反应迅速、灵敏度高、成本低和反应结果可视化,适用于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和表皮葡萄球菌的现场快速检测,为奶牛乳腺炎致病菌的快速检测提供了技术支撑。