鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis, DVH）是一种急性病毒性传染病，主要表现有传播快、死亡率高，肝脏出现特征性出血。该病侵害4周龄以内的雏鸭，特别是3周龄以内的雏鸭最易感染，是危害养鸭业最为严重的传染病之一。VP3是鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus, DHV）的主要结构蛋白之一，位于病毒壳体的表面，在VP3的氨基端含有主要的抗原决定簇，能够诱导机体发生免疫反应。通过对VP3蛋白进行截短表达，为研究VP3蛋白的免疫学功能，也为鸭病毒性肝炎基因工程疫苗的研究奠定基础。研究随机选取Ⅰ型鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus type Ⅰ, DHV-Ⅰ）vp3基因的1-468位进行截短表达，并纯化表达所得融合蛋白，用此融合蛋白建立间接ELISA方法，初步应用于安徽省部分鸭场的DHV-Ⅰ抗体检测。具体如下：首先根据GeneBank所登陆的Ⅰ型鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus type Ⅰ, DHV-Ⅰ) A66株（DQ886445） vp3基因序列，设计了一对扩增vp3截短基因（1-468）的特异性引物。将扩增的vp3截短基因与原核表达载体PET-32a(+)连接，构建了vp3截短基因的重组表达质粒pET-VP468。用Novagen公司pET系列载体通用引物T7promoter primer(#69348-3)和T7terminator primer(#69337-3)对构建的重组质粒进行PCR鉴定，提取鉴定正确的重组质粒，与对照载体pET-32a(+)一起转入表达菌E.Coli Rosetta-gami (DE3) pLysS中，使用IPTG诱导表达，获得融合蛋白Trx-VP468。分析融合蛋白的表达方式并大量表达融合蛋白Trx-VP468。利用Ni2+-NTA亲和层析柱对表达蛋白Trx-VP468进行纯化，使用不同公司的BCA蛋白定量试剂盒测定融合蛋白的浓度并进行Western-blot分析。经SDS-PAGE电泳结果表明，pET-VP468在大肠杆菌中表达了一个相对分子量约为36kDa的蛋白。融合蛋白以不溶的包涵体形式存在。免疫印迹试验表明Trx-VP468得到了正确表达。其次，以纯化的DHV-ⅠA66株免疫SPF鸭制备高免血清作为阳性血清。初次免疫将弗氏完全佐剂与病毒等量混合并乳化完全，第二次和第三次免疫将弗氏不完全佐剂与病毒等量混合乳化，对SPF鸭进行免疫，抗原剂量约为300μg。三次免疫每次间隔10天，第二次和第三次免疫后1周采集血液制备血清并检测其抗体效价，效价符合要求者留作阳性血清。效价检测采用固定病毒——稀释血清法，用已知毒价的病毒检测所制备阳性血清的抗体效价，最终测得阳性血清效价为1：90.51。最后，用Trx-VP468作为抗原包被酶标板，建立检测DHV-Ⅰ抗体的间接ELISA方法。用十字交叉连续稀释分析法（criss-cross serial-dilution analysis）确定ELISA方法中各试剂的最佳工作浓度；同时对一抗孵育时间、二抗反应时间、底物显色时间等条件进行优化；利用上述优化条件测定156份健康鸭的血清，计算出阴阳性血清临界值及结果判定标准。十字交叉连续稀释分析法确定最佳抗原包被量为10μg/ml，最佳血清稀释度为l：100，兔抗鸭二抗最佳稀释度为1：1000；一抗孵育、二抗反应、底物显色最佳时间分别为1h，0.5h，15min；阴阳性临界值为0.372。应用建立的间接ELISA方法对安徽省部分地区临床收集的鸭血清进行抗体检测，331份鸭血清样品检测结果抗体检出阳性率为73.1%（242/331）。试验结果表明，vp3截短基因在大肠杆菌中获得了正确表达，所得重组蛋白经纯化后纯度较高。初步应用表达所得蛋白建立了间接ELISA方法，对安徽部分地区收集鸭血清样品进行DHV-Ⅰ抗体检测，证明表达所得重组蛋白可以作为抗原用于检测DHV-Ⅰ抗体。试验结果为DHV-Ⅰ结构蛋白免疫学功能的研究以及基因工程疫苗的研发奠定了基础。