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猪链球菌(Streptococcus suis)是一种重要的猪病原体,它能够引起猪的多种疾病包括脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎,甚至导致死亡。在猪链球菌33个血清型中,猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)是临床分离最多的、毒力最强的病原菌,在给世界的养猪业带来了巨大的经济损失的同时,也能通过患病的动物或者污染的生猪肉副产品感染人类,威胁人类健康,严重的可引起人死亡。双组分信号转导系统(Two-component signal transduction system,TCS)广泛存在于细菌中,调节各种重要的细菌生理和代谢过程,在细菌的毒力和致病性方面发挥重要作用,但是对于猪链球菌中参与逃避天然免疫反应的双组分调控系统尚不清楚。本实验室已有ΔTCS2(ΔbceRS)、ΔTCS3(ΔnisKR)、ΔTCS4(ΔsalKR)、ΔTCS5(ΔciaRH)、ΔTCS6(ΔvicK)、ΔTCS8(Δihk/rr)、ΔTCS11(Δ1910KR)等双组分基因缺失株。本课题利用同源重组构建了ΔTCS1(ΔvraSR)、ΔTCS7(ΔSC841438hk/1439rr)、ΔTCS9(ΔSC841523hk/1522rr)、ΔTCS10(ΔcovR)、ΔTCS12(ΔSC841840rr)、ΔTCS13(ΔrevS)、ΔTCS14(ΔSC841925rr)、ΔTCS15(ΔvirSR)等双组分基因缺失株,并用PCR内外部引物验证成功获得15个双组分基因缺失突变株。通过猪链球菌2型野生株SC19与天然免疫细胞互作以及猪链球菌2型15个双组分基因缺失突变株在人全血中的存活能力比较,筛选出了1个重要的双组分调控系统VraSR,并探究了其在帮助猪链球菌2型逃避宿主免疫过程中发挥的作用以及毒力功能的作用。主要结果如下:1.15个双组分系统基因缺失突变株在人全血中存活能力的比较将猪链球菌和人血互作,并在1 h、2 h、3 h分别收集样品计数,与初始菌量比较计算存活率。结果表明,野生株和15个突变株均在人全血中呈现不断增殖的趋势。但是与野生株相比较,其中ΔvraSR和Δihk/rr增殖能力明显下降。2.猪链球菌2型感染人中性粒细胞后双组分调控蛋白的表达变化将猪链球菌2型野生株与人中性粒细胞互作3 h,收集样品提取细菌总RNA,检测15个反应调控蛋白表达水平。结果表明,与未经中性粒细胞刺激的对照组相比,vraR(SC840373),ciaR,SC841224,SC841439和SC841522基因上调明显。3.VraSR在天然免疫反应中的作用筛选出了双组分调控系统VraSR,进一步通过中性粒细胞杀菌验证野生株SC19、ΔvraSR、CΔvraSR对免疫细胞的抵抗能力。结果证实了缺失了VraSR后,猪链球菌在中性粒细胞中存活能力明显下降。随后采用流式细胞术检测中性粒细胞对野生株SC19、ΔvraSR、CΔvraSR的吞噬,体外模拟吞噬后的杀菌途径:氧化杀伤(H2O2)和非氧化杀伤(溶菌酶),均表明了缺失VraSR后,猪链球菌抵抗能力明显减弱。4.VraSR参与调控猪链球菌荚合成和细胞黏附荚膜的厚度影响着中性粒细胞对猪链球菌的吞噬,我们通过透射电镜检测了SC19、ΔvraSR、CΔvraSR的荚膜变化,并比较了唾液酸水平的差异和荚膜合成相关基因的表达差异。结果表明,缺失VraSR后,猪链球菌荚膜变薄。此结果与ΔvraSR黏附HBMEC细胞能力下降相悖,进一步通过qPCR发现缺失株体内与细胞黏附相关基因下调明显,表明双组分调控系统VraSR调控细胞黏附相关基因表达作用大于调控荚膜合成相关基因作用。5.VraSR基因缺失株对致病性和炎症反应的影响以BALB/c小鼠为模型,存活曲线和组织载菌量表明,双组分调控基因VraSR缺失后小鼠死亡率明显降低,猪链球菌更容易被机体清除。在感染初期,突变株和野生株引起的炎症因子表达水平无差异;在感染后期,突变株所引起的炎症反应明显低于野生株。