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甘蔗黄叶病(Yellow Leaf Disease,YLD)是由甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,SCYLV)引起的一种流行性病害,在全球种植甘蔗的国家和地区均有发病,严重影响甘蔗的产量与品质。SCYLV属于黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属的成员之一,含有6个开放阅读框(Open Reading Frames,ORF),其中ORFO编码的P0蛋白具有RNA沉默抑制子的功能。马铃薯卷叶病毒属P0蛋白序列和结构差异较大,氨基酸一致性也很低,P0蛋白沉默抑制子的作用机制不尽相同。SCYLV-P0蛋白抑制基因沉默的作用机制仍不明晰,为此,本论文以SCYLV-CHN3基因型分离物GZ18编码的P0蛋白(以下简称P0CHN3)为研究对象,开展以下研究:首先,对P0CHN3蛋白进行保守结构域的预测分析,发现存在6个保守结构区域,处于第 1-50、51-71、76-125、129-157、161-210和211-251氨基酸残基,几乎涵盖整个ORF0。本研究对P0蛋白的N端和C端15个氨基酸、类似F-box盒以及这6个保守结构域,分别进行片段缺失,构建缺失突变体载体,通过农杆菌介导的瞬时表达系统注射浸润本氏烟(Nicotiana benthamiana),逐一验证其RNA沉默抑制子活性。实验结果证明P0CHN3蛋白缺失任意一段保守结构域,或者N端和C端15个氨基酸、类似F-box盒均可导致RNA沉默抑制子活性显著降低。其次,比较马铃薯卷叶病毒属不同病毒的P0氨基酸序列后,发现存在12个保守位点,分析SCYLV基因型病毒群体P0蛋白选择压力后,发现11个氨基酸为阳性选择位点。为此,我们逐一进行单点突变验证P0CHN3蛋白这几个关键氨基酸位点是否为发挥沉默抑制子功能的关键位点。通过农杆菌介导的瞬时表达系统注射浸润本氏烟,实验结果表明,P0CHN3蛋白中的1 1个阳性选择位点氨基酸突变后不影响P0抑制RNA沉默活性,但是,在F-box盒中L85氨基酸以及保守氨基酸位点R138突变为丙氨酸A后,导致抑制子活性明显降低。这说明L85和R138位点均是发挥抑制子活性的关键氨基酸。最后,利用酵母双杂交(Yeast two hybrid,Y2H)技术分析P0CHN3与NbSKP1和Nb14-3-3蛋白的分子互作,结果表明,P0CHN3与NbSKP1在酵母细胞内仅存在微弱互作,而与Nb14-3-3蛋白存在较强互作信号,说明P0CHN3沉默抑制子与Nb14-3-3蛋白有紧密关系。本论文通过POCHN3蛋白片段缺失和点突变分析,筛选定位到了影响P0CHN3蛋白的RNA沉默抑制子活性的关键氨基酸,定位到影响P0CHN3蛋白的RNA沉默抑制子活性的保守结构域,并发现P0CHN3蛋白与Nb14-3-3蛋白有强烈的互作关系,这些研究成果为下一步开展SCYLV与植物互作的分子机制奠定了基础。