背景及目的:新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019,COVID-19）的病原体2019-n CoV（2019 Novel Coronavirus）是一类具有囊膜、线性单股正链的RNA病毒,基因组序列长度约29 kb。属于冠状病毒科乙型冠状病毒属严重急性呼吸道综合征相关冠状病毒种[1]。国际病毒分类委员会于2020年2月12日正式将其命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）[1]。它与SARS-CoV病毒及MERS-CoV病毒同属于冠状病毒科β病毒属但不同进化树分支,是第七种可感染人类的冠状病毒[2],具有高致病性及感染性极强的特点。其中HCoV-NL63,HCoV-229E,HCoV-OC43,HCoV-HKU1通常只导致轻度上呼吸道疾病,并在婴儿、幼儿和老年人中出现罕见的严重感染。但SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2却可以感染下呼吸道并引发人类严重的呼吸道疾病[2,3]。尤其是SARS-CoV-2带来了政治、经济、生活上的巨大震荡和在全球范围内蔓延的严峻形势[4]。SARS-CoV-2的潜在宿主包括多种哺乳动物,可通过上呼吸道入侵人体。与SARS-CoV相似,SARS-CoV-2通过人血管紧张素转化酶2（Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2）受体,主要感染肺部、肾脏、心脏多个靶器官[5,6]。SARS-CoV-2 Spike（S）蛋白的受体结合结构域（Receptor binding domain,RBD）负责识别和结合宿主细胞表面的受体ACE2,在病毒的入侵过程中至关重要。SARS-CoV-2 S蛋白对ACE2的亲和力比SARS-CoV S蛋白高10-20倍[7,8],这也是SARS-CoV-2高传染性的主要原因[9,10]。因此,S蛋白是重要的免疫原,是疫苗设计、治疗性抗体以及阻断病毒入侵的小分子药物的关键靶点。截至目前,全球累计确诊感染人数已超过5.1亿人,并且以每天数百万人的速度增长。新冠肺炎的防控,隔离传染源成为初期最重要的手段,但是要战胜新冠疫情,疫苗、抗体和药物也是不可或缺的武器。目前已经有多种疫苗投入使用,包括重组RBD疫苗、灭活疫苗、腺病毒载体疫苗、m RNA疫苗在内的多种疫苗[11]。由于SARS-CoV-2病毒具有高度变异性的特点,其S蛋白的突变导致的多个变异株传播,从最初的野生型毒株,经历了D614G、Alpha、Beta、Gamma、Delta、直到最近Omicron毒株的大流行[12-15]。正是由于其S蛋白上的氨基酸变异导致了抗原漂移,使得病毒可以逃避宿主免疫应答,影响疫苗的免疫保护效果,因此疫苗接种后产生的免疫保护的持续性,以及对突变株的交叉保护性如何,仍然是目前关注的热点和难点问题[16,17]。随着SARS-CoV-2突变株的出现,中和性抗体针对突变株的保护效果需要进一步评估。金艾顺教授团队发现了两株RBD特异性单抗58G6和510A5,在感染SARS-CoV-2和其变异株B.1.351（Beta）的h ACE2转基因小鼠中表现出较强的预防效果[18]。张林琦团队提出的BRII-196联合BRII-198单抗联合疗法获得了中国药品监督管理局（NMPA）的应急批准上市,用于治疗轻型与普通型,并伴有进展为重型新冠肺炎高风险因素的青少年和成人,但在全球多中心、双盲、安慰剂对照的随机临床试验中,SARS-CoV-2中和性单抗Sotrovimab、BRII-196加BRII-198在改善成年新冠肺炎住院患者的临床转归上没有显示出比安慰剂更好的效果[19]。在抗病毒药物的研发方面,目前依然没有发现针对SARS-CoV-2疗效显著的特异性药物,已有的抗病毒药物大部分无效。抗HIV药物克力芝（洛匹那韦和利托那韦）在治疗新冠肺炎的临床试验中效果差并且副作用大。武汉病毒所汪曼丽等报道了氯喹和瑞德西韦在体外能够抑制SARS-CoV-2病毒,半数抑制浓度(IC50)分别为1.13和0.77μM[20]。氯喹作为一种已经上市的抗疟疾药物,用于尝试治疗新冠肺炎,但是后续研究发现氯喹/羟氯喹并不能阻止病毒对肺腺癌细胞Calu3的感染和复制[21]。而瑞德西韦在中国开展的三期临床试验因为病人数量不足而终止,已有的数据没有显示出显著的统计学差异[22]。辉瑞公司新冠特效药PAXLOVIDTM在1219名COVID-19患者中的二三期临床试验结果显示,症状开始发作3天内用药,患者住院和死亡率与安慰剂组相比降低了89%;在28天的观察中,治疗组有1%（6/607）入院,无死亡病例;安慰剂组有6.7%（41/612）入院,10人死亡[23]。国家药监局已于2022年2月审批通过了PAXLOVIDTM在临床的应用,但是长期抗病毒疗效有待进一步观察。传统的病毒中和试验需要操作活病毒而存在较大的生物安全隐患,因此急需建立一种在BSL-2实验室可以用于SARS-CoV-2研究的方法。本研究基于HIV-1骨架的慢病毒系统,将缺失SARS-CoV-2 S蛋白C端结构域19个氨基酸的重组质粒与编码单荧光素酶的HIV-1骨架质粒共转染,在HEK293T细胞包装出了SARS-CoV-2假病毒。我们同时建立了稳定表达人ACE2的HEK293T细胞系,用于评估SARS-CoV-2假病毒感染效率。通过化学发光法检测假病毒及其突变株侵染细胞的荧光素酶（Luciferase）活性,依据发光值定量评估了COVID-19患者康复期血浆中和能力及动态变化、单克隆抗体的中和能力、SARS-CoV-2突变株感染效率和入胞抑制剂效果。本研究获得了安全高效的SARS-CoV-2假病毒系统,并以此为平台促进SARS-CoV-2突变株的研究与抗病毒药物的筛选。方法:1.SARS-CoV-2假病毒系统的建立:我们建立了可以稳定表达ACE2的293T-ACE2细胞系,合成了可以表达SARS-CoV-2 S基因的重组质粒p CMV3-SARS-CoV-2-S-FL（p S-FL）,并以此为模板,通过基因重组构建了S蛋白C端突变体表达质粒p CMV3-SARS-CoV-2-S-Mut（p S-Mut）和S蛋白C端19个氨基酸缺失的表达质粒p CMV3-SARS-CoV-2-S-C19del（p S-C19del）。将三种S表达质粒分别与携带荧光素酶报告基因的慢病毒载体p NL4-3.Luc.R-E-共转染HEK293T细胞,包装出高滴度的SARS-CoV-2假病毒。人水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）糖蛋白（glycoprotein,G）表达质粒p MD2.G与p NL4-3.Luc.R-E-共转染HEK293T细胞包装出VSV-G假病毒用于对照。通过检测假病毒感染293T-ACE2细胞后72小时后的荧光素酶活性评估了SARS-CoV-2三种假病毒的感染效率;随后通过检测72小时荧光素酶活性比较了SARS-CoV-2 S蛋白与VSV-G蛋白包装的假病毒对293T及293T-ACE2细胞的感染效率,评估了蛋白酶抑制剂卡莫司他（Camostat）和E-64d抑制假病毒感染的效果。建立SARS-CoV-2假病毒中和试验方法,验证了COVID-19康复期血浆与重组血管紧张素转换酶2-免疫球蛋白Ig G1（Angiotensin-converting enzyme 2-Immunoglobulin G1,ACE2-Ig）对假病毒的中和作用。最后利用中和试验筛选了44株靶向RBD的SARS-CoV-2单克隆抗体的中和能力。2.SARS-CoV-2 S-G614假病毒构建及病毒感染性,抗体中和活性研究:利用生物信息学分析了GISAID数据库的SARS-CoV-2 S蛋白的氨基酸序列。利用pS-D614重组质粒,通过点突变技术构建了p S-G614重组质粒,与携带荧光素酶报告基因的慢病毒载体p NL4-3.Luc.R-E-在1:1的体系下共转染HEK29T细胞,包装高滴度的SARS-CoV-2 S-G614假病毒。pS-D614与p S-G614外源性转染HEK293T细胞48小时后,利用Western Blot分析了S蛋白的切割情况。通过检测SARS-CoV-2 S-D614与SARS-CoV-2 S-G614假病毒感染293T-ACE2细胞后72小时的荧光素酶活性,我们研究了S-D614与S-G614假病毒在24、48、72小时的入胞效率、ACE2-Ig中和能力、elastase-2与sivelestat对假病毒入胞的影响。我们通过测定假病毒感染72小时后293T细胞中的荧光素酶活性,将Camostat与E-64d进行连续梯度稀释,比较它们在对抗VSV-G、S-D614、S-G614假病毒进入能力的差异。最后利用假病毒中和试验分析了分别来自重庆医科大学附属永川医院、重庆市公共卫生救治中心、重庆市万州三峡中心医院共计70例新冠病人康复期血浆对抗S-D614与S-G614假病毒的ID50。3.鉴定双苄四氢异喹啉类生物碱抑制S-G614假病毒入胞:我们以pS-D614重组质粒为模板,通过基因重组构建了SARS-CoV-2 S基因N501Y氨基酸位点变异的突变体表达质粒p S-N501Y.V1和p S-N501Y.V2、SARS S基因表达质粒p S-SARS、MERS S基因表达质粒p S-MERS。将p S-G614、p S-N501Y.V1、p S-N501Y.V2、p S-SARS、p S-MERS与p NL4-3.Luc.R-E-通过1:1的比例共转染HEK293T细胞,包装出S-G614、S-N501Y.V1、S-N501Y.V2、S-SARS、S-MERS假病毒。我们收集了含有188种化合物的药物库,分析了它们在20μM的浓度下在293T-ACE2细胞中抵抗S-G614假病毒入胞的能力,并挑选出效果最好的9种化合物。分别在病毒进入前、病毒进入期、病毒进入后处理,通过不同组合方式测定了这9种化合物对抗S-G614入胞的时机。随后分别测定了它们在Calu3、A549-ACE2、293T-ACE2细胞中对抗S-G614假病毒入胞的EC50（concentration for 50%of maximal effect）和CC50（concentration of cytotoxicity 50%）。我们利用不同细胞系中EC50最好的5种化合物,通过倍比稀释的方法,确定了它们在对抗S-G614、S-N501Y.V1、S-N501Y.V2、、S-SARS、S-MERS、VSV-G假病毒入胞的EC50。我们采用了细胞膜融合实验、竞争性ELISA实验、差示扫描荧光法（DSF）实验、钙离子耗竭实验、细胞胆固醇测定实验探讨了这5种化合物对抗SARS-CoV-2的入胞机制。最后,我们用SARS-CoV-2活病毒感染Vero E6细胞,通过观察细胞病变效应及实时荧光定量PCR,检测目标化合物对抗SARS-CoV-2感染的效果。结果:1.成功构建了293T-ACE2稳定转染细胞系。三个SARS-CoV-2 S基因表达质粒p S-FL,p S-Mut和p S-C19del均在HEK293T细胞中检测到了S蛋白的表达,其中缺乏了S蛋白结构域中C末端19个氨基酸的重组质粒p S-C19del还检测到了S蛋白的完整条带和切割的S1亚基。同时,激光共聚焦显微镜结果显示,S-FL主要定位于内质网,S-Mut和S-C19del促进了S蛋白向细胞膜表面的运输。我们用p S-FL、p S-Mut、p S-C19del、p MD2.G与p NL4-3.Luc.R-E-共转染HEK293T细胞成功包装出了SARS-CoV-2假病毒和VSV-G假病毒,并用它们感染了HEK293T和293T-ACE2细胞,结果显示,VSV-G假病毒均可以有效入侵两种细胞系,测定的荧光素酶活性相当。但SARS-CoV-2假病毒在293T-ACE2细胞的荧光素酶活性是HEK293T的1200倍（P＜0.001）。SARS-CoV-2假病毒在感染293T-ACE2细胞时,在S-C19del假病毒中观察到最高病毒感染性（8.02±0.11）×10~4RLU,72小时达到最高的感染效率（5.77±0.28）×10~4RLU。我们检测到了两种蛋白酶抑制剂Camostat和E-64d在293T-ACE2细胞中对SARS-CoV-2假病毒入胞的抑制活性,Camostat不能抑制感染,E-64d在2μM浓度下阻断效率为95%（RLU=2909±986.2）。我们利用假病毒系统建立测试COVID-19患者恢复期血浆中和抗体以及单克隆抗体的方法。三份恢复期血浆结果显示,它们的半数中和效价（NT50）分别为412、745和1930。确定了S蛋白受体结合结构域（RBD）的8#、15#、16#、20#、25#、30#单克隆抗体有SARS-CoV-2-S假病毒最好的中和效果。2.我们从GISAID数据库的病毒基因组序列中分析了SARS-CoV-2 S蛋白的氨基酸序列,发现了一个全球性分布的S蛋白突变株,即D614G,在序列分析里占了64.6%的比例。利用了PROSPER软件预测了S蛋白变异株中的蛋白酶潜在切割位点,并在S-G614蛋白S1-S2连接的615-616位残基上发现了一个新的丝氨酸弹性蛋白酶（elastase-2）切割位点。我们发现与HEK 293T细胞相比,当S-D614和S-G614假病毒感染后,293T-ACE2细胞的荧光素酶活性分别增加了约250倍（P＜0.001）和530倍（P＜0.001）,且S-D614和S-G614假病毒均被ACE2-Ig有效抑制,它们的IC50值分别为0.13μg/m L和0.15μg/m L。对于S-G614假病毒,在48小时的入胞效率比S-D614增加了2.2倍（P＜0.01）,最高入胞效率（2.50±0.41）×10~4 RLU在S-G614假病毒感染72 h后观察到,其水平约为S-D614假病毒的2.4倍（P＜0.01）。当293T-ACE2细胞在感染假病毒前用100μg/m L弹性蛋白酶处理后,S-G614假病毒感染细胞的RLU值（6.86±0.85）×10~4是S-D614（2.17±0.15）×10~4的3.1倍（P＜0.01）;在100μg/m L弹性蛋白酶存在的情况下,丝氨酸蛋白酶抑制剂西维来司他（sivelestat）剂量依赖性地阻断了S-G614的入胞。这些结果表明了含有附加弹性蛋白酶-2切割位点的S-G614假病毒的感染性被外源弹性蛋白酶增强,因此S-G614假病毒对sivelestat比S-D614假病毒更敏感。在缺乏跨膜丝氨酸蛋白酶2（Transmembrane protease serines,TMPRSS2）表达的293T-ACE2细胞中,丝氨酸蛋白酶抑制剂Camostat不能抑制S-D614或S-G614假病毒感染,而半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64d显著阻断了这两种假病毒的进入,其IC50分别为0.37μM和0.24μM。在70份COVID-19恢复期病人血浆针对S-D614与S-G614的中和试验中,我们发现了65份血浆对S-D614和S-G614假病毒均表现出效果相当的中和活性,而5个血浆样本（1#、7#、40#、42#和52#）对S-G614假病毒的抑制率下降（P＜0.05）。1#、7#、40#、42#和52#的血浆对S-D614假病毒有较高的中和活性,其ID50在729-1524之间,但对S-G614假病毒的中和活性降低,ID50在216至367之间,中和活性降低2.5至5.9倍（P＜0.05）。这些数据表明,大多数（93%）感染早期SARS-CoV-2变异的患者的抗血清可以交叉中和S-G614变异,但D614G变异降低了对7%康复血清的中和敏感性。3.我们利用了SARS-CoV-2 S-G614假病毒系统对188个化合物在20μM时的入胞抑制活性进行了筛选,确定了41个抑制S-G614假病毒相对感染率到30%以下的化合物。定了9个特异性抑制SARS-CoV-2 S-G614假病毒入胞的化合物（SC9、SC161、SC171、SC182、SC183、SC184、SC185、SC186和SC187）,它们对抗SARS-CoV-2 S-G614假病毒的半数有效浓度(EC50)均小于10μM。在这几种化合物中,除了SC171外,其余化合物均为双苄基异喹啉类生物碱（钙离子通道拮抗剂）。随后我们通过分别在假病毒感染前,感染中,感染后三个阶段添加化合物,确定这9种化合物都在初始阶段可以通过靶向宿主因子来阻断S-G614假病毒感染。在293T-ACE2、A549-ACE2、Calu3这3种细胞系中的S-G614假病毒实验中,我们发现SC9、SC161、SC171、SC182和SC185这5种化合物的EC50均在5μM以下,可以预见到很好的应用前景。千金藤碱（Cepharanthine,SC9）、鹤氏唐松草碱（Hernandezine,SC161）、3,3’-（1,3-亚苯基双（氧基））双（1-（4-甲基哌啶-1-基）丙-2-醇）（3,3’-（1,3-phenylenebis（oxy））bis（1-（4-methylpiperidin-1-yl）propan-2-ol）,SC171）、汉防己碱（Tetrandrine,SC182）和甲基莲心碱（Neferine,SC185）可明显抑制冠状病毒入胞。它们在体外有效保护了三种细胞系（293T-ACE2、Calu3和A549-ACE2）免受不同冠状病毒（SARS-CoV,MERS-CoV,SARS-CoV-2[S-D614,S-G614,N501Y.V1和N501Y.V2变异株]）的感染,其EC50值为0.1–10μM。我们随后通过竞争性ELISA实验、差示扫描荧光法（DSF）实验排除了SC9、SC161、SC171、SC182和SC185通过干扰RBD-ACE2相互作用起效。通过细胞膜融合实验、进一步发现这些化合物可有效抑制S蛋白介导的膜融合。在HEK293T细胞内钙离子耗竭实验中,20μM钙螯合剂BAPTA-AM耗竭胞内Ca2+后,显著降低了约70%的S-G614假病毒入胞（P＜0.001）。更重要的是,当细胞被20μM BAPTA-AM与四种化合物中的任意一种组合处理时,这些化合物对抗S-G614假病毒的入胞阻断作用降低了10倍以上（P＜0.001）。我们在Vero E6细胞模型证实了筛选靶标化合物SC9、SC161、SC171和SC185的抗SARS-CoV-2活性。SARS-CoV-2活病毒感染Vero E6细胞48h观察到了病毒感染引起的细胞结构和形态变化。在10μM化合物SC9、SC161、SC171和SC185处理组中的RNA水平分别为DMSO对照组的0.08%（P＜0.001）、70.27%（P＜0.01）、43.55%（P＜0.001）和76.98%（P＜0.05）,这些结果表明,SC9、SC161、SC171和SC185对SARS-CoV-2活病毒有不同程度的抑制作用。结论:我们采用带有荧光素酶报告基因的HIV-1慢病毒载体成功构建了高滴度的SARS-CoV-2假病毒系统,可以在BSL-2实验室用于对SARS-CoV-2这一高传染性、高致病性的新兴病原体的研究。明确了S-G614假病毒比S-D614假病毒有更强的入胞能力,并发现了D614G突变在S蛋白中额外的弹性蛋白酶2切割位点,从而促进其S蛋白的切割导致病毒更易进入细胞,导致SARS-CoV-2变得更具感染性。同时也发现了在7%的COVID-19恢复期患者中,D614G突变降低了病毒对血浆中和抗体的敏感性。鉴定了一组双苄四氢异喹啉类生物碱类化合物作为冠状病毒的入胞抑制剂。这些抑制剂在体外有效保护不同细胞系（293T、Calu3和A549）免受不同冠状病毒的侵入感染。这些化合物会阻断宿主的钙离子通道,从而抑制钙离子介导的膜融合并抑制冠状病毒侵入。我们的研究为SARS-CoV-2抗病毒药物的发现提供了新类型的先导化合物,同时假病毒系统将有助于SARS-CoV-2突变株的研究,以及为针对COVID-19的新型疫苗和治疗方案的设计提供新思路。