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随着对DNA复制起始蛋白及其调控因子研究的不断深入，人们对DNA复制起始调控机理的了解也越来越透彻，但详细的调控模式仍不清楚，有待通过寻找更多的新复制起始蛋白或调控因子来加以阐明。本研究以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)为研究对象，运用两种不同的筛选策略来寻找新的DNA复制起始蛋白：一种是本联合研究室创立的全面筛选新DNA复制起始蛋白的方法-IDR(Initiation of DNA Replication)筛选，通过甲基磺酸乙酯(EMS)诱变酵母细胞、转化质粒(p1ARS与p8ARSs)鉴定复制起始突变体及基因组文库的基因互补挽救等几步筛选，鉴定得到两个新的DNA复制起始蛋白——Ctf4p与Adk1p。Ctf4p(Chromosome Transmission Fidelity4)已知参与粘粒(Cohesion)的建立与DNA复制的控制，但未有其参与DNA复制起始过程的报道；Adk1p是一种腺苷酸激酶(Adenylate Kinase)，主要作用是维持细胞内腺苷酸水平的稳定。另一种筛选方法是以DNA复制起始蛋白Noc3p为“诱饵(bait)”蛋白，利用细菌双杂交系统从酵母cDNA文库中筛选与Noc3p相互作用的蛋白，筛选得到2,600个与Noc3p相互作用的文库质粒(1,100个表现强的相互作用，1,500个表现弱的相互作用)，其中有6个新蛋白(Srp1p、Tdh3p、Cdc19p、Eno1p、Eno2p及Tma19p)被鉴定出来。
本研究对筛选到的两个新DNA起始候选蛋白Ctf4p与Adk1p进行了深入研究。突变株W10(ctf4-idr)具有典型的复制起始缺陷(idr)表型：可造成p1ARS每代10.27％的丢失率(高丢失)而p8ARSs2.94％的丢失率(中等丢失)，表明突变后的Ctf4p以一种与复制区(Autonomously replicating sequence，ARS)直接的或间接的作用而影响了质粒DNA复制起始的稳定性。对CTF4缺失及过量表达后细胞的温度敏感性与DNA损伤的药物(HU)敏感性实验发现，CTF4是一温度依赖的必需基因(CTF4缺失后细胞在37℃不能生长，但能在25℃正常生长)；Ctf4p被诱导过量表达后的DNA损伤表型比ctf4△表现更敏感，并使菌株产生一定的idr表型。对温度敏感株GAL-ctf4-td在细胞周期不同时间(G1期、S期及G2/M期)的同步化、Ctf4p-td降解、释放并进行DNA含量的流式细胞分析结果表明，Ctf4p-td的降解会使DNA复制延迟起始进入S期，但不会影响DNA复制的延伸与有丝分裂的进行。细胞周期的染色质结合实验表明Ctf4p结合染色体是依赖于细胞周期的调控的。酵母双杂交、免疫共沉淀及合成致死的实验表明，Ctf4p不仅与复制前期复合物(pre-replication complex，pre-RC)组装的必需蛋白有物理上的相互作用(Cdt1p)及遗传上的相互作用(Mcm2p与Mcm5p)，还与pre-RC的激活蛋白有物理上与遗传上的相互作用(Mcm10p与Pol1p);另外Cdt1p和Sld5p分别与Ctf4p的两段结构域(C端部分与N端部分)都有相互作用，而Mcm10p和Pol1p分别只与N端部分和C端部分有相互作用。研究还发现GINS与Pol1p有物理上的相互作用，它们可能与Ctf4p及Mcm10p一起组成一个复合物来调控DNA复制的起始。
突变株F1(adk1-idr)也具有显著的idr表型：可造成p1ARS每代2.56％的丢失率(中等丢失)而p8ARSs每代0.539％的丢失率(低丢失)，表明突变了的Adk1p以一种与ARS直接的或间接的作用而影响了质粒DNA复制起始的稳定性。对ADK1缺失后细胞的温度敏感性实验发现，ADK1是一温度依赖的必需基因(表现为细胞在37℃不能生长而在25℃能正常生长);Adk1p部分结构缺失(Lid△与Ct△)及突变(K19E)后的表型与adk1△的一致，这可能是由于Adk1p的这些氨基酸的缺失或突变破坏了Adk1p的酶活性造成的。对突变株adk1-td在细胞周期不同时间(G1期、S期及G2/M期)的同步化、Adk1p-td降解、释放并进行DNA含量的流式细胞分析结果表明，Adk1p-td的降解会使DNA复制不能起始进入S期，但不会影响DNA复制的延伸与有丝分裂的进行。“七组分”染色质结合试验及细胞周期的染色质结合实验表明，Adk1p在整个细胞周期内都结合在染色体上。酵母双杂交与免疫共沉淀的实验未检测到Adk1p与pre-RC蛋白(ORC、Cdc6p、Cdt1p及MCM)之间有物理上的相互作用。已知复制起始基因的温度敏感变株及idr突变株的多拷贝的校正实验未发现Adk1p与pre-RC蛋白之间有遗传上的相互作用，但发现Adk1p与NTP代谢过程中尿苷酸激酶Ura6p(Uridylate Kinase)有遗传上的相互作用：表现为F1的idr表型可以被高拷贝的URA6挽救，但不能被所检测的其它参与调控NTP或dNTP水平的激酶或蛋白的相应高拷贝基因(YUK1、CDC8、YNK1、YCF1、ATP16、SML1及RNR1-4)所挽救。idr菌落大小的表型实验表明温度敏感突变株ura6-td(尿苷酸激酶)没有idr的表型，表明高拷贝的URA6之所以能挽救F1的idr表型可能是通过其过量表达的激酶活性来实现的。因此Adk1p可能在整个细胞周期都结合在染色体上，为复制起始蛋白供给起始DNA复制时所需要的能量。