目的:叉头框/翼状螺旋转录因子 P3（Forkhead box/winged helix transcriptional factor P3,FoxP3）是一种广为人知的多功能转录因子,负责调控一系列炎症和发育相关基因的表达,通过调控T细胞活性参与感染、癌症和心血管疾病的病理进程。本课题组前期研究首次发现FoxP3在心肌细胞（cardiomyocytes）中表达,且在心肌重构（cardiac remodeling）时表达下调,但其作用机制尚不明确。线粒体稳态失衡是心肌重构时心肌细胞的重要病理改变,可诱发线粒体损伤并激活线粒体自噬（mitophagy）,参与心肌重构的病理进程。因此,本研究将围绕心肌重构过程中线粒体自噬的调控机制,探讨心肌细胞FoxP3在心肌重构中发挥的作用,并采用雷公藤甲素进行干预研究,为今后开展转化医学研究奠定基础。方法:在整体实验中,采用异丙肾上腺素（isoproterenol,Iso）诱导雄性C57BL/6小鼠或FoxP3DTRC57BL/6小鼠产生心肌重构。在体外实验中,采用血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,AngⅡ）刺激大鼠心肌细胞株H9c2或乳大鼠心室肌细胞（neonatal rat ventricular myocardiocytes,NRVMs）发生心肌肥大。在体内外实验中,使用雷公藤甲素（triptolide,TP）作为抑制心肌重构的干预药物。采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色法、FITC-麦胚凝集素（wheat germ agglutinin,WGA）染色法和Masson三色染色法观察心肌重构变化,采用罗丹明-鬼笔环肽染色法观察心肌细胞肥大,采用免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）、免疫印迹（immunoblotting,IB）和免疫荧光（immunofluorescence,IF）观察蛋白的表达和分布,采用免疫荧光、免疫印迹检测蛋白在心肌细胞中的表达和分布,采用实时PCR（real-time PCR）检测mRNA表达。在自噬研究中,采用IF、IB检测自噬标志分子——微管相关蛋白 1 轻链 3（microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3）的表达,以此评价自噬激活水平、自噬流和标记自噬部位;采用透射电镜（transmission electron microscopy,TEM）和荧光共定位观察线粒体自噬;采用免疫印迹和荧光共定位确定介导线粒体自噬激活的关键分子。采用荧光共定位、免疫沉淀（immunoprecipitation,IP）和染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）检测FoxP3与靶分子之间的相互作用。体外实验中,采用siRNA敲低（knock-down）FoxP3和自噬关键基因的表达,采用腺相关病毒（AAV）为载体过表达FoxP3。本研究分三个部分,技术路线依次为:第一部分:首先,在体内外重构模型中观察FoxP3的表达和胞内分布,探讨其表达的空间特征;然后,在体外模型中观察FoxP3 mRNA表达及其蛋白表达和分布在重构过程中的动态变化,探讨其表达的时间特征;最后,在体外模型中观察不同浓度TP对FoxP3在细胞浆和细胞核中分布的影响。通过上述研究内容,阐明FoxP3在心肌重构过程中的时空表达特征。第二部分:首先,在体内外重构模型中观察LC3空间分布和时间变化,确定自噬激活细胞类型和检测时间点;然后,在体外模型中观察自噬类型、自噬流改变,以研究重构中的自噬特点;最后,采用siRNA敲低自噬相关基因5（autophagy-related gene 5,Atg5）、PTEN诱导激酶1（PTEN-induced kinase 1,Pink1）和Parkin的表达,确认参与心肌重构中线粒体自噬激活的关键分子。通过多种体内外自噬检测方法,确认心肌重构中自噬的类型、发生通路和关键激活分子。第三部分:首先,在体外模型中观察关键分子Parkin及其转录因子——激活转录因子4（activatingtranscription factor4,ATF4）的表达特征;其次,在体外模型中敲低或过表达FoxP3,然后观察Parkin表达和其介导的线粒体自噬的改变,从而确认FoxP3对心肌细胞Parkin-线粒体自噬具有负调控作用;再次,观察FoxP3缺陷小鼠的心肌重构和线粒体自噬的改变,以确认FoxP3对心肌重构中Parkin介导的线粒体自噬具有负性调控作用;然后,在体外模型中检测FoxP3结合Parkin启动子能力的变化,探讨其通过直接作用于启动子从而干扰Parkin转录的可能性;接下来,继续采用体外模型,探讨FoxP3与细胞核中的ATF4直接结合的可能性。结合线粒体自噬检测和两种机制研究的结果,确认FoxP3对心肌重构中Parkin-线粒体自噬的调控作用并阐明其作用机制。结果:第一部分:心肌细胞Foxp3在心肌重构过程中的表达和核转位下调Iso诱导小鼠发生明显的左心室重构包括心肌细胞肥大、心肌纤维断裂、间质纤维化和炎性细胞浸润,并且心肌细胞FoxP3的表达显著下调。在体外模型中,AngⅡ诱导心肌细胞发生显著的心肌肥大,并且FoxP3的mRNA表达、蛋白表达及核转位均从心肌细胞暴露于AngⅡ的早期开始显著下调。而在体内外模型中,TP均能恢复甚至上调心肌细胞的FoxP3表达和核转位,该作用可能与TP的抗心肌重构作用相关。第二部分:确认Parkin介导心肌重构中的线粒体自噬在小鼠心肌重构过程中,自噬主要发生于心肌细胞,从重构早期就持续性积累。在体外模型中,心肌细胞自噬同样从早期开始积累,这是自噬过度激活而不是降解受阻的结果。TP干预在体内外均具有抑制自噬激活的作用。在心肌重构过程中,心肌细胞自噬的主要类型为Atg5参与的、由Pink1-Parkin通路介导的线粒体自噬过度激活。其中,Parkin是心肌重构中介导线粒体自噬过度激活的关键自噬衔接蛋白,也是TP发挥作用的效应分子,因为TP通过下调Parkin表达抑制心肌线粒体自噬。第三部分:FoxP3通过阻碍ATF4介导的Parkin转录从而负调控心肌重构中Parkin-线粒体自噬在体外重构模型中,敲低FoxP3表达导致心肌细胞Parkin表达上调,从而导致Parkin-线粒体自噬进一步上调,并且TP对Parkin-线粒体自噬的抑制作用丧失;与此相反,FoxP3过表达导致心肌细胞Parkin表达下调,从而抑制Parkin-线粒体自噬,此时TP对Parkin-线粒体自噬的抑制作用也丧失。体内实验表明,FoxP3敲除导致小鼠心肌线粒体自噬的过度激活和心肌重构恶化,并证实TP对心肌重构和线粒体自噬的抑制作用依赖于FoxP3,最终确认FoxP3通过负调控Parkin表达从而抑制线粒体自噬和心肌重构。在体外重构模型中发现,心肌细胞FoxP3下调Parkin表达的机制有两种:一是直接结合位于Parkin启动子中ATF4结合元件（element）下游的FoxP3结合元件,阻碍ATF4介导的Parkin转录;二是直接结合细胞核中的ATF4,间接抑制Parkin转录。总之,FoxP3通过阻碍ATF4介导的Parkin转录从而负调控心肌重构中Parkin-线粒体自噬;TP通过恢复FoxP3表达和核转位抑制Parkin表达,从而抑制线粒体自噬和心肌重构。结论:心肌重构过程中心肌细胞FoxP3表达和核转位下调,导致Parkin表达迅速上调和线粒体自噬过度激活。心肌细胞FoxP3通过结合位于Parkin启动子中ATF4结合元件下游的FoxP3结合元件,以及结合细胞核中的ATF4,直接和间接阻碍ATF4激活Parkin转录,从而下调Parkin mRNA表达。TP通过恢复心肌细胞FoxP3表达和核转位抑制Parkin表达,从而抑制线粒体自噬和改善心肌重构,有望成为基于靶向FoxP3策略的新型抗心肌重构药物。