论文部分内容阅读
研究背景口腔鳞状细胞癌（Oral squamous cell carcinoma,OSCC）简称口腔鳞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤,约占口腔颌面部恶性肿瘤的90%以上,约占全身恶性肿瘤的3%。是全球发病率和死亡率较高的肿瘤,OSCC发生于唇部或口腔,由于OSCC特殊的解剖位置及其恶性生物学特性,早期诊断较为困难,因此可能被误认为是其它常见疾病。大多数OSCC是由口腔粘膜癌前病变引起的,它容易向周围组织肌肉、神经等发生浸润,且容易早期淋巴结转移,因此治疗难度大、预后效果较差,由于缺乏能够常规应用于临床治疗的特异性生物标志物,给临床早期诊断带来了极大的挑战。目前OSCC的治疗早期多以手术切除为主,中晚期以放射治疗、化学治疗以及靶向治疗等手段加以辅助,但其术后易发生转移和复发,并且大多数OSCC患者在诊疗时已是晚期,其5年的生存率仅为50%。因此探索OSCC早期诊断,术后监测潜在的分子标志物,及其分子机制和作为治疗靶点的可能性,对提高OSCC患者生存率和改善预后,具有一定的现实意义。长链非编码RNA（long non-coding RNA,LncRNA）广泛存在于人类基因组内,常定位于细胞浆内或核内,本身缺少开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,它的长度超过200个核苷酸,是一种没有编码蛋白能力的分子。LncRNA通常位于基因间序列、内含子序列或重叠区域,随着基因组测序工程的发展,已发现LncRNA可以调控真核生物的几乎所有活动,并且能在表观遗传调控,转录和转录后等水平进行基因编码和调节。越来越多的研究发现LncRNA能从基因和蛋白层面上调节肿瘤细胞的恶性生物学行为,参与多种恶性肿瘤的发生发展和转移过程。研究发现,LncRNA生长特异抑制物5（LncRNA of growth arrest-specific 5,LncRNA GAS5）在OSCC中表达下调,通过激活PTEN/AKT轴抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭。LncRNA PDIA3P1在OSCC中显著高表达,是潜在的预后监测的分子标志物,可以靶向结合miR-185-5p上调细胞周期蛋白D2的表达,促进OSCC细胞的增殖。LncRNA在OSCC中作为癌基因或抑癌基因来发挥作用。研究发现,LINC01303位于14q23.1染色体上;胃癌中LINC01303高表达,通过介导miR-101-3p抑制肿瘤的发生和发展。LINC01303在喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）患者中过表达,并通过调节miR-200c/TIMP2轴促进喉鳞状细胞癌细胞增殖,由此可见,LINC01303是一个很有前景的肿瘤生物学标志物,然而,LINC01303在OSCC患者的肿瘤组织中的分布表达情况并不清楚,及其发挥的作用和具体的生物学机制也不清楚,因此探究LINC01303在OSCC中的表达分布及作用和相关分子机制,对于OSCC的早期诊断,术后监测和精准治疗具有非常重要的临床意义。研究目的本研究目的为进一步明确LINC01303的分布和表达情况,分析其在OSCC中的作用,以期探索一种用于OSCC早期诊断和疗效监测的潜在分子标志物,并为揭示OSCC生长侵袭及远处转移的分子机制,及寻找新的治疗靶点提供理论依据。材料与方法通过收集临床样本,检测LINC01303在OSCC组织和癌旁正常组织中的表达水平差异,进一步通过荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）实验明确LINC01303在细胞中的定位。体外实验探究LINC01303对TSCCA,SCC-25细胞增殖、迁移和侵袭性的影响。通过q RT-PCR进一步验证LINC01303在OSCC细胞中与正常人口腔角质上皮细胞（Normal Human Oral Keratinocyte,NHOK）的表达差异,通过siRNA降低或通过转染过表达质粒增加LINC01303在OSCC细胞中的表达后,观察体外干预LINC01303的表达对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭性的影响。体内实验探究LINC01303对OSCC进展和迁移的影响,通过裸鼠皮下注射sh-LINC01303-knockdown的OSCC细胞,观察与注射sh-NC-OSCC细胞的裸鼠相比,检测肿瘤的体积大小以及钙粘蛋白和波形蛋白转录RNA的表达,以明确LINC01303对OSCC的生长和侵袭转移的影响。通过Star Base在线数据库,筛选出LINC01303影响OSCC进展的下游关键靶miRNA—miR-429,通过双荧光素酶基因报告实验验证LINC01303与miR-429的关系,并进一步通过Target Scan数据库筛选出miR-429的下游关键靶基因—锌指E（Zincfinger E-box Binding Homeobox 1,ZEB1）,通过双荧光素酶基因报告实验和miR-429探针,验证miR-429和ZEB1的结合。通过体内外干预miR-429/ZEB1轴,观察干预miR-429/ZEB1轴后LINC01303对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭性作用以及对OSCC进展和转移的影响。研究结果通过收集临床样本发现,LINC01303在OSCC组织的表达显著高于癌旁正常组织,FISH实验明确LINC01303主要在细胞质中表达。通过q RT-PCR进一步研究发现LINC01303在肿瘤细胞中的表达显著高于正常口腔上皮角质细胞,通过siRNA降低LINC01303在OSCC细胞中的表达后,肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著降低,转染过表达质粒增加LINC01303在OSCC细胞中的表达后,肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的显著增强。进一步通过体内实验探究LINC01303对OSCC发生和发展的影响,通过裸鼠皮下注射sh-LINC01303-knockdown的肿瘤细胞,与注射sh-NC肿瘤细胞的裸鼠相比,肿瘤体积更小,且侵袭性显著减弱。通过star Base在线数据库,筛选出LINC01303影响OSCC进展的下游关键靶miRNA—miR-429,通过双荧光素酶基因报告实验明确LINC01303可直接调控miR-429,并进一步通过Target-Scan数据库筛选出miR-429的下游关键靶基因—ZEB1,通过双荧光素酶报告实验和miR-429探针,验证miR-429和ZEB1的结合。为了证实LINC01303通过miR-429/ZEB1轴参与肿瘤发生和进展过程,我们进行共转染实验sh-NC+inhibitor-nc、sh-NC+miR-429 inhibitor、sh-LINC01303+inhibitor-nc和sh-LINC01303+miR-429 inhibitor转染TSCCA和SCC-25细胞。通过实验确定了ZEB1的表达、及其在OSCC增殖和侵袭中的作用。q RT-PCR结果显示,转染sh-NC+miR-429 inhibitor后,ZEB1在TSCCA和SCC-25细胞株中的相对表达量明显增加。然而,sh-LINC01303+miR-429 inhibitor共转染可抑制miR-429 inhibitor介导的ZEB1的上调。CCK-8实验表明,转染sh-NC+miR-429 inhibitor后,肿瘤细胞增殖能力明显增强。Transwell实验显示,转染sh-NC+miR-429 inhibitor后,侵袭的肿瘤细胞数量增加sh-LINC01303与miR-429inhibitor共转染后,肿瘤细胞（TSCCA和SCC-25）的细胞增殖和侵袭活性显著降低,说明LINC01303介导miR-429/ZEB1轴促进肿瘤的进展。通过抑制ZEB1的表达可以显著减弱LINC01303过表达诱导的肿瘤细胞的增殖能力和侵袭性。研究结论研究明确了LINC01303主要分布在OSCC胞质中且表达显著增加,并通过体内、外实验证明降低LINC01303的表达后可以显著减弱OSCC细胞的增殖和侵袭性。抑制miR-429/ZEB1轴后可以显著减弱LINC01303过表达诱发的OSCC细胞增殖和侵袭性。因此,LINC01303可通过调控miR‐429/ZEB1信号通路的表达促进OSCC的增殖和侵袭,LINC01303将有望成为OSCC发生和发展的生物学标志物,调控LINC01303也将为OSCC的治疗提供新的思路和靶点。