【摘 要】
：
CRISPR/Cas系统是大多数细菌与古菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统,主要用来抵御噬菌体或其他病原体核酸的重复入侵。目前研究最深入、应用最广的两类CRISPR/Cas系统是II类II型的CRISPR/Cas9系统及II类V-A型的CRISPR/Cas12a（也称CRISPR/Cpf1）系统,其均为单体效应蛋白在导向RNA的介导下发挥核酸干扰功能。CRISPR/Cas12a系统与较
论文部分内容阅读
CRISPR/Cas系统是大多数细菌与古菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统,主要用来抵御噬菌体或其他病原体核酸的重复入侵。目前研究最深入、应用最广的两类CRISPR/Cas系统是II类II型的CRISPR/Cas9系统及II类V-A型的CRISPR/Cas12a（也称CRISPR/Cpf1）系统,其均为单体效应蛋白在导向RNA的介导下发挥核酸干扰功能。CRISPR/Cas12a系统与较早发展起来的CRISPR/Cas9系统相比具有许多优势,包括:兼具RNA核酸酶与DNA核酸酶功能,导向RNA短,蛋白分子量小,识别靶点PAM范围不同,切割位点远离PAM,产生黏性末端,脱靶效应低等。CRISPR/Cas12a系统目前被鉴定且验证在细胞中存在编辑效率的同源蛋白已有10余种,但是,Cas12a家族成员的编辑修复的特征及效率等关键问题尚未得到系统深入的研究。解决这些问题对阐释Cas12a作用机制以及降低脱靶效率等具有重要的理论意义,对工程改造Cas12a为基础的基因编辑工具的开发和应用同样具有重要的指导价值。本论文通过构建自切割的成对crRNA-靶点文库,在高通量水平研究CRISPR/Cas12a系统的无模板编辑修复特征及编辑效率。取得的创新成果包括以下四点:（1）详细分析哺乳动物细胞内Cas12a系统的无模板编辑修复特征。结果表明不同于Cas9,Cas12a系统的编辑修复结果以缺失为主,由非同源性末端接合（Non-homologous end joining,NHEJ）介导的1～8bp短片段缺失及微同源末端连接（Microhomology-mediated end joining,MMEJ）介导的12～18bp稍长片段缺失两部分构成。同时还发现影响Cas12a编辑修复特征的因素有:细胞系遗传背景（DNA修复途径偏好性）、靶点上下游序列特征及不同CRISPR/Cas效应蛋白等。（2）比较研究了10种Cas12a同源蛋白在HEK293T及RKO细胞系内的编辑效率。筛选出了3个蛋白分子量更小且编辑效率较高的Cas12a家族成员:Bs Cas12a,Pr Cas12a及Mb3Cas12a。（3）以Cas12a结构规律为基础,改造上述3个Cas12a同源蛋白,分别构建3精氨酸替换突变体:Bs Cas12a-3Rv（K155R/N512R/K518R）,Pr Cas12a-3Rv（E162R/N519R/K525R）,Mb3Cas12a-3Rv（D180R/N581R/K587R）。验证了3个Cas12a突变体对包含改造目标PAM（NTTV,TTCV,TRTV）靶点编辑效率的提高,并分析其识别PAM的碱基偏好性差异:3个Cas12a突变体在PAM TRTV的靶点中对PAM-3位R（R=A,G）表现出不同的碱基偏好性:Pr Cas12a-3Rv和Bs Cas12a-3Rv表现出对G碱基的偏好明显高于A;而Mb3Cas12a-3Rv对A/G的碱基偏好性不明显,二者编辑效率相当。3个Cas12a突变体在NTCV PAM靶点对PAM-4位N（N=A,C,G,T）表现出不同的碱基偏好性:Pr Cas12a-3Rv和Bs Cas12a-3Rv表现出对T碱基的偏好明显高于V（V=A,C,G）;而Mb3Cas12a-3Rv表现不同,其对A碱基的偏好与T相当,且明显高于C/G碱基。（4）详细研究crRNA二级结构对Cas12a编辑效率的影响,鉴定出两类严重影响靶点效率的crRNA结构形式,并找到了相应的解决办法,即,可以通过缩短crRNA spacer长度,或者通过调整5端骨架序列来改变crRNA二级结构,进而提高靶点编辑效率。综上所述,本论文详细研究了CRISPR/Cas12a的无模板编辑结果特征及影响因素,深入比较研究了10种Cas12a同源蛋白在细胞中的编辑效率,筛选出3个分子量较小、编辑效率较高的Cas12a成员。并通过改造影响编辑效率的关键氨基酸位点和crRNA结构特征来优化Cas12a系统的靶向范围及编辑效率,并预测主要的编辑产物类型。这些研究成果有助于加深对Cas12a系统作用机制的理解,推动Cas12a系统在哺乳动物细胞中作为基因编辑、转录调控、成像示踪等相关工具的开发,以及在动植物基因功能研究、微生物代谢工程、临床诊断、基因治疗等领域的应用。
其他文献
体育保险作为一种风险管理举措,是化解学校体育伤害事故赔偿纠纷,保证学校体育工作正常运转的重要手段。采用访谈法、文本分析法、个案研究法、SWOT分析法等研究方法对学校体育保险模式问题进行深入研究。首先,根据现状调研,分析学校体育保险现实困境,提出学校体育保险专业化发展思路,阐明政府、学校与社会在学校体育保险发展中的责任,并结合试点提炼已有模式,对模式要素进行分析;其次,以模式研究方法为指导,围绕学校
金属-有机框架物（Metal-organic Frameworks,简称MOFs）是指由有机配体与无机金属离子或金属簇以自组装的形式通过配位键构筑的具有周期性一维、二维、三维网格的新型晶态多孔材料。MOFs这类材料和传统的多孔材料相比具有较高的孔隙率和比表面积等特点。同时,由于可选择组装的金属离子（或金属团簇）的多样性和有机配体结构的可调性,使得MOFs的结构具有较好的可设计性。近年来,越来越多新
生物质资源的开发和利用对于人类社会的可持续发展具有重要意义。木质纤维素类生物质是最为丰富的生物质资源,其分子结构以C-O和C-C键为主,对生物质分子结构单元定向剪切和转化制备高值化学品具有可行性,同时也存在较大的挑战。本论文针对生物质分子中C-O和C-C键的选择性催化活化反应开展研究,目的在于探索和开发简单高效的策略实现生物质原料的高效催化转化获得可应用于化学工业的高值含氧化学品,如芳香醛、酮化合
由于科技的日新月异,计算机视觉被广泛的应用在各个领域中,其中,关于节省储存空间、视频识别、滤除干扰及其整合应用为当前重要的课题。本文提出架构于视觉错觉理论的全向式视频摄取整合处理应用,在视觉错觉理论的基础上引入数据压缩编码技术等数学模型研究分析图像压缩编码、模糊量化识别等技术原理及机制模型,希望能够在图像处理、计算机视觉等相关领域得到应用。本文首先介绍视觉视频感知技术原理及相关的智能优化与图像处理
第一部分PTCHD1在难治性癫痫患者（Temporal lobe epilepsy,TLE）及两种动物模型中的表达实验目的:用免疫印迹的方法检测PTCHD1在两种（海人酸及戊四氮）慢性癫痫小鼠模型脑组织中的表达及难治性癫痫患者和对照组表达情况。方法:1.从本课題组之前脑标本库中（约380例难治性颞叶癫痫患者术后脑组织和约100例非癫痫脑外伤患者脑组织）随机选取15例难治性颞叶癫痫脑组织作为实验组,
作为一种二阶非线性光学方法,和频光谱（Sum Frequency Generation,SFG）在具有中心对称的介质中是禁阻的,在两相界面处,随机分布的体相中心对称性遭到破坏,因此具有独特的表界面选择性。电化学反应的场所是电极表面,迄今为止,许多研究致力于将SFG应用于电化学过程的研究,避免体相信号的干扰,在原位条件下获得电极表面分子吸附、取向、动力学等信息。然而对于实际电化学反应体系检测的困难和
自从2001年聚集诱导发光（Aggregation-induced emission,AIE）现象被首次报道后,这一领域迅速成为了分子材料的研究热点。科学家们设计合成了各种类型的分子,AIE分子因优异的光学性能被广泛应用于生物化学传感、光动力治疗、光电器件和生物成像等领域。四苯乙烯类化合物（Tetraphenylethylene,TPE）作为具有AIE活性的典型分子之一,因为其易于修饰和具有高效的
原发性肝癌（Primary liver cancer,PLC）是全球最常见的恶性肿瘤之一,根据组织学分型,PLC可分为肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）、胆管细胞肝癌（cholangiocellular carcinoma,CC）及混合型肝癌（HCC-CC）。其中绝大多数为HCC,占PLC的90%。有机阴离子转运体 2（organic anion transpo
从2007年起,深圳市工商局在全市流通领域逐步建立并完善消费者权益服务站,全面推行以消费争议和解在先为原则的消费者权益保护工作
缺血性脑卒中是临床常见的一种发病率、致残率、致死率高的急性血管性疾病,严重威胁人类生命健康。目前临床缺血性脑卒中主要治疗手段是再通血管,以保证大脑血液及能量供应,然而脑供血恢复的同时会导致严重的再灌注脑损伤。由于脑缺血再灌注损伤的病生机制并不完全清楚,缺乏有效的临床干预策略,因此深入研究脑缺血再灌注损伤的病生机制,寻找有效的药物干预靶点已成为神经精神药理学、神经病学等研究领域的热点与焦点问题。补体