猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）是已知感染哺乳动物最小的DNA病毒,主要引起猪圆环病毒相关疾病,导致患病猪免疫系统产生高度免疫抑制,继而引发其他病毒和细菌的感染。PCV2基因组进化速率惊人,自1998年发现以来PCV2已进化出了 PCV2a～PCV2h 8种不同基因亚型,这给PCV2的防控带来极大阻碍。由于目前国内外的商品化疫苗主要是基于PCV2a和PCV2b基因型研发的,无法满足当前PCV2基因亚型多样性的防控需求,因此了解当前本地区PCV2的流行趋势并针对该趋势制定防控措施,对我国PCV2疫情防控具有极其重要的意义。本研究首先对河北省部分地区PCV2的流行情况进行调查,发现各地区均存在PCV2阳性感染情况,阳性感染率约为29.6%。将检测为阳性的PCV2毒株进一步筛选,经PK-15细胞对PCV2感染毒株进行分离,并通过对感染的细胞病毒液进行PCR鉴定、间接免疫荧光鉴定、透射电镜观察等,确定分离毒株的病毒粒子为PCV2,并将其命名为CH/HB/XT01。同时对所有阳性样品进行全基因组测序,共获得12条全基因组序列,通过遗传变异分析发现其分别属于PCV2a、PCV2b和PCV2d分支,其中7株属于PCV2d基因亚型;随后对其高变异区ORF2基因进行核苷酸及氨基酸序列分析,发现其抗原表位区存在多处氨基酸突变位点及基因重组事件。以上结果证实PCV2具有较高的进化速率,且由于流行毒株之间基因型的不同,造成了宿主免疫力或毒株致病性的改变,致使PCV2仍在猪群中流行。PCV2 ORF2基因编码PCV2最具免疫原性的衣壳蛋白,该蛋白是开发PCV2基因重组疫苗的主要目的基因。本研究根据对当前河北省部分地区PCV2的遗传变异分析,确定当前流行毒株为PCV2d基因亚型,由此利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统构建了针对PCV2d Cap蛋白的病毒样颗粒疫苗。首先对PCV2d Cap基因组序列进行扩增纯化,将其克隆至pFastBac1载体后转化至DH10Bac感受态细胞以获得重组Bacmid载体,经无内毒素质粒提取试剂盒提取获得重组杆粒,将鉴定正确的重组杆粒转染至Sf9细胞,对转染后的细胞进行病变观察、间接免疫荧光鉴定及透射电镜观察,结果显示重组杆粒成功转染至Sf9细胞,并在细胞内完成正确折叠并进行自我组装形成完整的病毒样颗粒。随后经SDS-PAGE和Western Bolt鉴定,表明重组杆粒Bacmid-dCap可在Sf9细胞内正确表达。由于重组蛋白表达与外界因素如重组杆状病毒的MOI、接种时间等有关,本研究探究了重组蛋白的最佳表达条件,将获得的重组杆状病毒以不同的MOI接种Sf9细胞后,重组蛋白均获得有效表达,但最佳的攻毒量MOI为1;设定不同时间收获重组杆状病毒,发现在72 h左右收获重组蛋白其目的蛋白表达量最高。为了进一步验证本研究制备的重组杆状病毒是否可以诱导机体产生强大的免疫保护,将最优条件下获得的目的蛋白病毒样颗粒以肌肉注射的方式免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA抗体检测和小鼠脾淋巴细胞增殖试验进行免疫原性分析,结果显示本研究制备的重组杆状病毒免疫后14 d即有PCV2特异性抗体产生,免疫后28 d抗体水平趋于平稳;以不同浓度的PCV2病毒液刺激分离的脾淋巴细胞可观察到经重组杆状病毒免疫的脾淋巴细胞产生了显著的增殖,表明本研究制备的PCV2 VLPs可诱导小鼠产生高水平高特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答,为PCV2防控提供技术支持。