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酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor, aFGF)是一种存在于中枢及外周神经系统组织中，对中胚层和神经外胚层来源的多种细胞有营养和促分裂分化作用的重要生长因子。aFGF广泛参与多种生理和病理过程，在促进创伤愈合，营养和促进神经生长，诱导血管形成及再生等方面具有重要的医学价值。研究目的：利用基因工程技术生产活性蛋白不仅可以大幅提高目标蛋白的产量，还能按照人们的需要改变蛋白的特性，生产出具有优良特性和新功能的生物活性药用蛋白。尽管aFGF是一种生物学效应广泛的生长因子，但在实际应用于某种疾病治疗时，人们更希望它具有较好的细胞特异性。目前商品化的haFGF(human acidic fibroblast growth factor)几乎都是利用大肠杆菌表达的重组haFGF，缺乏明显的细胞特异性。先后有人采用定点突变的方法对haFGF的结构进行改造，但在细胞特异性方面没有取得明显的效果。酵母表达系统具有蛋白质的翻译后修饰加工能力，能对表达的外源蛋白进行糖基化修饰，而大肠杆菌表达系统没有这一特点。对haFGF的mRNA序列分析发现haFGF中存在一些潜在的糖基化位点，这些位点分布在haFGF的三个功能区。糖基化修饰影响蛋白质功能已经得到了大量证实，利用真核异源表达系统对haFGF进行糖基化修饰可望实现对haFGF特性的改变，尤其当修饰发生在重要的功能区时，可能使haFGF产生新的优良特性，增加新的功能，加宽其临床应用的范围。我们构建haFGF的酵母表达系统，目的就是利用酵母本身所具有的蛋白质修饰加工系统，表达发生了特性改变的重组haFGF，实现对haFGF功能的改进，增加其细胞特异性。研究方法：本研究采用RT-PCR方法，进行了haFGF基因克隆；通过添加限制性酶切位点将haFGF基因定向克隆到相应的表达载体上，构建了haFGF的E.coli、S. cerevisiae 和P. pastoris三种表达系统；采用ELISA检测体系对E.coli/haFGF、S. cerevisiae/haFGF 和P. pastoris/ haFGF的发酵和表达条件进行了优化；采用肝素亲和层析和凝胶过滤层析方法分别对E.coli、S. cerevisiae 和P. pastori表达的rhaFGF进行了分离纯化；采用SDS-PAGE和Western blot对纯化的目标蛋白进行验证；对P. pastoris表达的haFGF进行了特性鉴定：包括生物活性、稳定性和对血管细胞生长的影响。研究结果：1．利用RT-PCR方法从患子宫肌瘤的妇女子宫内膜组织中成功克隆到了两种不同剪接方式的haFGF基因的编码区cDNA片段。测序结果表明其中一个cDNA片段由3个外显子构成，另一个cDNA片段由2个外显子组成。2．以BL21（DE3）为宿主菌、pET30a(+)为表达质粒，成功构建了E.coli /haFGF<WP=5>表达系统。利用肝素-sepharoseCL-6B亲和层析从诱导后的E.coli /haFGF细胞中分离纯化出rhaFGF（E）（Recombined human acidic fibroblast growth factor expressed by E.coli），经肠激酶酶切处理切除6×His标签后，得到了电泳纯的分子量为17kD的rhaFGF(E)。3．以INVSc1为宿主菌，pYES2为表达质粒，成功构建了S. cerevisiae /haFGF表达系统。Dot blot证实经60h摇瓶诱导，rhaFGF(S)（Recombined human acidic fibroblast growth factor expressed by S. cerevisiae）表达量达到最高。利用肝素-sepharose CL-6B亲和层析从细胞中纯化出rhaFGF(S)，其分子量为43kD。rhaFGF(S)分子量显著增加表明该蛋白进行了翻译后修饰，发生了结构改变。4．以KM71为宿主菌，pPIC9K为表达质粒，成功构建了P. Pastoris /haFGF表达系统。haFGF基因在该系统中通过整合到宿主的染色体上的方式进行外源基因的表达，表达方式为分泌型。从G418浓度为0.75g/L的转化平板上筛选到表达量相对较高的重组子。pH6.0, 0.5%甲醇诱导48h是最佳摇瓶发酵条件，在该条件下表达的rhaFGF(P)（Recombined human acidic fibroblast growth factor expressed by P. pastoris）经肝素-sepharoseCL-6B亲和层析和G100凝胶过滤纯化，得到两种分子量分别为17kD、35kD的蛋白，经Western blot证实，二者都是目标蛋白rhaFGF(P)： rhaFGF(P1)，17kD； rhaFGF(P2)，35kD。rhaFGF(P2)分子量增加，说明蛋白发生了翻译后修饰，有结构改变。5．rhaFGF(P)的生物活性、稳定性和促进血管内皮细胞(EC)和平滑肌细胞(SMC)增殖的特性。rhaFGF(P1)促进NIH3T3细胞增殖的活性比标准品haFGF高24%，rhaFGF(P2)的生物活性比标准品haFGF低51%；rhaFGF(P1)、rhaFGF(P2)与标准品haFGF一样在水溶液中的储藏稳定性较差。4℃处理rhaFGF后，其增殖能力很快下降，rhaFGF(P1)9天后完全失活、rhaFGF(P2) 7天后完全失活。60℃处理，rhaFGF(P1) 7.5min后完全失活, rhaFGF(P2) 6min后完全失活；与标准品E.coli表达的rhaFGF相比，低浓度下rhaFGF(P1)能更加有效地促进EC生长，抑制SMC增殖。高浓度rhaFGF(P1)强烈促进SMC增殖，rhaFGF(P1)浓度为35.3nmol/L时促进SMC增殖能力最大，可达到对照的3.5-4倍；rhaFGF（P1）浓度为3.53-11.76nmol/L时EC增殖达到最大，为对照的1.5倍。因此，在促进活体血管内皮愈合和防止内膜增生的作用上，低浓度rhaFGF（P1）很可能比E.coli表达的rhaFGF更有优势，这对于预防血管成形术后再狭窄