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葡萄糖氧化酶以氧分子作为电子受体将β-D-葡萄糖转化成为葡萄糖酸,同时产生过氧化氢。微生物生产的葡萄糖氧化酶由于其在化工、医药、食物、饮品、临床化学、生物技术和其他工业中的广泛应用而在近些年收到了极大的关注。近几年葡萄糖氧化酶在生物传感器上的应用更加大了对其的需求量。在多种工业生产中和作为一种分析酶应用正对生物过程产生越来越多的影响。本论文利用毕赤酵母GS115中成功合成并分泌了黑曲霉Z-25的葡萄糖氧化酶GOD-A,经过发酵最终测定酶活达到17.35U·mL-1。单独在酵母中表达黑曲霉葡萄糖氧化酶具有局限性,单纯依靠甲醇利用快型菌株与多拷贝菌株的筛选无法进一步提高酶活,而理性基因改造中的易错PCR手段等都有研究者进行过研究,得到的结果并不能够达到工业化推进的要求,因此,提高酶活的工作需要引入新的改造手段来进行。于是在利用毕赤酵母GS115表达来自于黑曲霉Z-25葡萄糖氧化酶基因GOD-A的基础上进行酶蛋白与菌株的非理性改造,利用高效率的筛选平台对非理性构建的菌株库进行筛选,最终得到性状良好的菌株。1)利用DNA Shuffling技术对黑曲霉葡萄糖氧化酶基因进行单基因的改造,在酵母体系中进行表达,经过筛选得到P.pastoris-GS115-pPIC9K-GOD(SFL-A),7d摇瓶的发酵酶活达到32 U·mL-1,3L发酵酶活达到767U?ml/’。2)引入青霉葡萄糖氧化酶基因,进行双基因的嵌合基因库的建立,在酵母体系中进行表达,经过筛选得到P.pastoris-GS115-pPIC9K-GOD(SFL-A+P),7d酶活最高达到41 U.mL-1,3L发酵酶活达到927 U?mL-1发酵酶活达到927U?mL-1。3)改造酵母菌株,利用全局转录调控(gTME)手段,对TATA盒结合蛋白(TPB)进行突变,提高菌株的蛋白表达量,得到P.pastoris-GS115-pPIC9K-GOD(SFL)-13-pPICZaA-Aa-TBP,3d酶活达到24U/ml-1,酶活与对照组18 U?ml/i相比商出33%。采用传代培养的方式进行验证转化子的遗传稳定性。第一代与第五代的发酵酶活分别为21.66 U?mL-1与23.87 U?mL-1表明传代前后菌株巧活能够稳定存在,转化子遗传稳定性良好。采用抗生素梯度鉴定菌株基因拷贝数,对比的结果显示改造之后的基因拷贝数与表达原始基因菌株中的基因拷贝数都为7-12个拷贝,因此判断酶活提髙是由于基因的改变所导致的。针对于热稳定性的改造,得到一株有提窝的菌株#2S菌株,残留酶活2.56%,与出发菌相比(1.85%)提高了38%。