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血管活性肠肽(Vasoactive intestinal peptide,简称VIP)是组成皮肤神经肽的重要成员之一,在不同的生物学条件下可由分布于表皮、基底层、真皮、汗腺以及毛囊等部位的感觉及自主神经末梢分泌。VIP是属于胃泌素/分泌素/胰高血糖素家族的分泌型多肽,由28个氨基酸组成并与有不同结构特点的G蛋白偶联受体-VIP受体1(VIP receptor 1,VIPR1)及VIPR2结合。VIP/VIPR系统的激活可介导血管扩张、血浆外渗、肥大细胞脱颗粒、免疫调节等多方面的生理过程。有研究报道VIP在特应性皮炎、银屑病等炎症性皮肤病的发病机制中起到重要的作用,而炎症性皮肤病的恢复期往往会导致炎症后色素沉着(Postinflammatoryhyperpigmentation,PIH)。目前有关 VIP 在黑色素生成过程中的作用方面研究尚未见报道。目的:探讨血管活性肠肽在黑色素生成过程中的作用以及相关机制。方法:1)利用VIP处理小鼠黑素瘤B16F10细胞,并以不同浓度分析细胞活性、黑色素含量,在不同时间段测定酪氨酸酶活性;2)分别利用RNA逆转录合成cDNA试验、实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)以及蛋白免疫印迹试验(Western blotting)来检测黑色素生成关键酶-酪氨酸酶(Tyrosinase)以及小眼畸形相关转录因子(microphthalmia associated transcription factor,MITF)基因的mRNA及蛋白质表达水平;3)通过Western blotting法在不同时间段对VIP诱导的信号通路相关蛋白PKA、CREB、p38MAPK、AKT、ERK1/2等磷酸化及总蛋白表达水平进行检测;4)利用选择性PKA抑制剂H89抑制cAMP-PKA-CREB信号通路,观察黑色素生成含量以及MITF、Tyrosinase等蛋白的表达变化,进一步确认有效的由VIP诱导的黑色素生成相关信号通路;5)通过Western blotting法检测小鼠黑素瘤B16F10细胞中VIP受体的表达情况;6)利用特异性VIPR1/R2小干扰RNA下调相应VIP受体的表达,观察黑色素生成含量以及Tyrosinase蛋白的表达变化,检测VIP诱导的促黑色素生成过程中有效的VIP受体信号通路7)通过黑色素生成含量测定以及Western blotting法检测Tyrosinase、MITF等相关蛋白的表达,进一步在人表皮黑色素细胞中验证VIP在黑色素生成过程中的作用。结果:1)小鼠黑素瘤B16F10细胞以及人表皮黑色素细胞以不同浓度VIP(1-100 nM)处理后,其黑色素含量以浓度依赖的形式递增,且在此浓度范围内未对细胞产生毒性;2)在B16F10细胞中,VIP有效地增加细胞内酪氨酸酶活性;3)VIP在B16F10细胞中显著地增加Tyrosinase以及MITF蛋白质表达水平;4)VIP在B16F10细胞中以时间依赖性的形式显著地增加了 MITF、Tyrosinase基因的mRNA表达水平;5)在B16F10细胞中VIP诱导CREB、PKA等蛋白的磷酸化,对p38 MAPK、AKT以及ERK等通路未见影响;6)利用选择性PKA抑制剂H89抑制PKA-CREB通路,明显地抑制了由VIP诱导的黑色素生成含量以及Tyrosinase、MITF等蛋白的表达增加;7)B16F10细胞表达VIP受体VIPR1及VIPR2;8)在B16F10细胞中利用特异性VIPR1/R2小干扰RNA下调相应VIP受体的表达,可降低由VIP诱导的黑色素生成含量以及Tyrosinase蛋白的表达增加;9)VIP在人表皮黑色素细胞中显著地增加黑色素生成含量;10)VIP在人表皮黑色素细胞中显著地增加Tyrosinase、MITF等蛋白的表达水平。结论:1)VIP在小鼠黑素瘤B16F10细胞及人表皮黑色素细胞中增加黑色素的生成含量;2)VIP增加酪氨酸酶活性以及tyrosinase基因的mRNA及蛋白质表达水平;3)VIP增加MITF基因的mRNA及蛋白质表达水平;4)VIP通过PKA-CERB-MITF-Tyrosinase信号通路促进黑色素的生成过程。