第一部分:致心律失常性右室心肌病(ARVC)患者心肌补体系统激活表达:研究背景致心律失常性右室心肌病(Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy,ARVC)是一类以恶性室性心律失常和心源性猝死为主要临床表现的遗传性心肌病,是35岁以下青年人心源性猝死的重要原因之一,其特征性病理改变为弥散性或节段性的心肌被纤维脂肪组织替代,伴或不伴有炎症浸润。目前对于ARVC的治疗主要是抗心律失常和预防猝死,缺乏针对疾病进程的靶向治疗方案。本团队已有数据表明中国人群中超过70%的ARVC心脏组织存在明显的炎症细胞浸润;补体作为炎症反应的重要活性分子,在ARVC小鼠模型(Des-/-)中通过小分子药物或者遗传学手段干预补体系统可以有效抑制心肌组织炎症反应及其病理重构。但目前尚无针对ARVC患者心肌组织中补体激活的系统性研究。研究目的探究补体系统在ARVC患者心肌组织中特异性激活状态。研究方法通过高分辨率定量蛋白组学技术(TMTlabeling)对4例ARVC、4例扩张型心肌病(DCM)、4例正常废弃供心的移植右室心肌组织进行蛋白定量,分析补体系统相关蛋白在各组之间表达水平;并通过免疫印迹法(Western Blot)、定量聚合酶链反应定量技术(RT-qPCR)、免疫组织化学法(IHC)在另一验证队列样本中(包含16例ARVC、16例DCM以及16例正常废弃供心的移植右室心肌组织)验证蛋白组学发现的补体系统在ARVC右室心肌组织中特异性激活的结果。研究结果定量蛋白组学结果证实:与正常对照比较,ARVC患者右室心肌组织中补体相关分子明显激活(C3,Fold change=1.74,P=0.008;C6,Fold change=1.52,P=0.001;C7,Fold change=1.57,P=0.001;C8,Fold change=1.53,P=0.005;C9,Fold change=1.78,P=0.0001)。对比ARVC移植患者和DCM移植患者的心力衰竭程度,发现DCM患者 LVEF 较 ARVC 更低(25.00±2.45%VS.47.53±4.87%),说明 DCM 可作为ARVC的心力衰竭阳性对照组;为排除补体激活是心力衰竭心肌组织的共同特征,对比ARVC和DCM移植患者心肌组织相关蛋白表达:发现ARVC右室心肌组织中补体相关蛋白激活程度显著高于DCM患者(C3,1.74±0.33VS.1.09±0.11,P=0.018;C6.1.52±0.14 VS.1.20±0.17,P=0.041:C7,1.57±0.18 VS.0.98±0.06,P=0.002;C8A,1.46±0.10 VS.0.97±0.24,P=-0.019;C9,1.78±0.15 VS.1.48±0.12,P=0.034)。说明补体在ARVC右室心肌组织中特异性激活表达。进一步在验证队列中利用Western Blot实验以及定量分析,发现 Factor B(Fold change=1.795,P<0.001)、ASP(Fold Change=4.194,P<0.05)、C5b-9(Fold change=1.585,P<0.001)、C5aR(Fold change=4.167,P<0.05)等补体分子在ARVC心肌组织中特异性激活。RT-qPCR实验证实补体相关受体基因(C5aR、C5L2)在ARVC心肌组织中特异性升高。免疫组化结果显示,与正常对照比较,ARVC患者心肌组织中补体分子(C5aR,C5b9,Factor B)明显沉积增多,并且在明显纤维脂肪化替代区域附近表达水平高,在相对正常区域表达水平相对较低。研究结论补体系统在ARVC患者心肌组织中特异性激活。第二部分:补体-凝血系统互作促进ARVC疾病进展:研究背景致心律失常性右室心肌病(ARVC)是一种遗传性心肌病,其以恶性心律失常和右室为主(部分左室受累)的心功能障碍为临床特征,我们对ARVC移植患者心肌组织的定量蛋白组学发现补体系统(C3,C6,C7,C8 and C9)明显激活表达。补体系统主要通过三条激活通路发挥作用(classical-,alternative-and lectin pathway),但是目前在患者临床试验中,均未发现上述补体通路干预可导致明显的临床获益。在2006年Huber-LangM等人发现补体系统还可以通过凝血系统激活:在C3敲除小鼠中,凝血系统因子thrombin可裂解C5,从而导致后续C5～9补体因子的级联激活。但是目前关于ARVC心肌组织中补体-凝血系统互作关系以及其参与疾病发生、进展的细机制未能完全揭示。研究目的本研究旨在探究ARVC心肌组织中凝血系统与补体系统之间的互作关系,以及其在ARVC心肌组织炎症反应以及病理重塑的作用。证实凝血因子thrombin可作为ARVC疾病病理进展的特异性干预靶点。研究方法首先蛋白组学(第一部分)数据中分析ARVC患者心肌组织中凝血系统相关分子(Tissue factor,Factor Ⅷ,Factor IX,Factor X,Factor XII,Fibrinogen,Thrombin等)表达水平,并在验证队列中(16例ARVC,16例DCM和16例正常供体)利用蛋白印迹和免疫染色等分子实验证实ARVC患者心肌组织中凝血系统特异性表达激活。通过构建Desmin基因敲除小鼠(Des-/-),并通过心脏超声、心电图、HE/Masson病理检测以及免疫染色等小鼠表型鉴定方法证实ARVC小鼠模型构建成功。将Desmin基因敲除小鼠与购买的C3基因敲除小鼠杂交得到Des-/-C3-/-双敲小鼠(抑制传统补体三大激活通路),对各基因型小鼠(Des-/-C3-/-,Des-/-,WT)进行长时间饲养,观察、记录其生存情况;分别在4月龄和12月龄对各基因型小鼠进行心脏超声、心肌病理损伤程度评估。利用免疫组化和酶联免疫吸附测定(ELISA)分析Des-/-C3-/-小鼠心肌组织(C5)以及外周血浆(C5a)中补体表达水平证实ARVC心肌组织中补体存在其他激活通路。并进一步利用免疫组化实验方法探究各基因型小鼠心肌凝血因子(Fibrinogen,Thrombin)表达特征。最后利用Thrombin特异性小分子抑制剂Lepirudin腹腔注射各基因型小鼠,并分析小鼠心肌组织中补体表达水平以及心肌病理损伤程度改变。研究结果以正常供心蛋白表达水平校正,定量蛋白组学提示ARVC患者心肌组织中凝血因子特异性表达激活(ARVC VS.DCM:Factor XIII A,Fold change 1.27±0.26 VS.0.79±0.10,P=0.026;Fibrinogen,Fold change 1.77±0.23 VS.1.44±0.38,P=0.026;Thrombin,Fold change 1.69±0.004 VS.1.09±0.21,P=0.004)。在验证队列(16 ARVC,16DCM,16正常供体)中利用Western Blot同样证实凝血因子fibrinogen和thrombin在 ARVC 心肌组织中显著激活表达(Fibrinogen Fold change=2.201±0.21,P<0.001;Thrombin Fold change=1.664±0.24,P<0.05);以及免疫荧光染色可发现 fibrinogen 在ARVC患者心肌间质组织明显沉积增多。构建Desmin基因敲除小鼠(ARVC小鼠模型),与WT小鼠比较,Des-/-小鼠心脏的左心室明显扩张(WT VS.Des-/-,LVESD(mm),1.842±0.1114 VS.2.833±0.3436,P=0.0208),以及心脏收缩功能明显下降(EF(%),82.18±2.685 VS.59.14±8.418,P=0.0262));Des-/-小鼠心肌与正常对照出现明显纤维化病理改变,脂质沉积以及生成相关基因激活表达。ARVC小鼠(Des-/-)心肌补体沉积增多,且主要集中在心肌病变严重区域;Des-/-小鼠复合C3基因敲除后导致ARVC小鼠疾病表型恶化:在8～13月龄期间死亡率明显升高(C3-/-Des-/-VS.Des-/-,16.6%(13/78)VS.4.3%(3/70),P=0.0041),左室收缩功能(LVFS,%)明显减弱(23.38±1.97VS.27.39±0.98,P<0.05),心肌组织病理损伤程度增加18%。对C3-/-Des-/-小鼠心肌组织进行C5的免疫组化染色,发现其沉积明显增多,利用ELISA对C5a/C5adesArg浓度进行检测,发现C3-/-Des-/-血浆表达水平显著高于 WT((5.5±0.82 nM,n=4 VS.0.56±0.12 nM,n=6),说明 ARVC 心肌组织中存在其他不同传统三大激活途径的补体激活通路。通过对Des-/-小鼠腹腔注射lepirudin处理(对照组利用PBS),Des-/-小鼠心肌组织纤维化、钙化沉积以及炎症细胞浸润等病理特征(replacementindex)下降25.5%;也可导致Des-/-心肌组织中C5蛋白表达水平明显下降(P<0.01)。说明在ARVC心肌组织中,凝血系统可促进补体系统激活,并导致疾病病理进展。研究结论ARVC患者心肌组织中补体系统、凝血系统表达激活;在ARVC心肌组织中凝血因子thrombin可直接激活补体系统介导心肌病理损伤;干预凝血-补体系统之间的互作关系有可能成为ARVC的治疗靶点之一。第三部分:补体、凝血系统激活预测ARVC患者不良预后:研究背景ARVC是一类以恶性室性心律失常和心力衰竭为主要临床表现的遗传性心肌病,目前临床工作中,主要基于心脏核磁共振以及心脏超声对心脏结构功能的检测来对ARVC患者进行临床风险分级,尚无血液生物标志物能够有效反映疾病进程,对并恶性心血管事件进行风险预测。前两部分基于蛋白组学和多种分子生物学实验证实ARVC心肌组织中补体-凝血系统互作表达激活,并可能参与ARVC疾病进展。研究目的探究ARVC患者外周血浆补体、凝血因子与疾病进展和临床预后风险相关性。研究方法采集87例ARVC患者,24例DCM患者及63例健康志愿者的血浆,并同期采集其临床资料(包含基线资料,血液化验,心脏超声,心电图等)。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测上述血浆样本中的补体、凝血因子浓度。利用Spearman秩相关检验分析血浆补体、凝血因子表达浓度与患者临床特征的相关性;定义ARVC患者随访期间心血管不良事件为死亡、心脏移植手术以及进入心脏移植等待名单;按照随访期间是否发生心血管不良事件将患者分组,比较组间血浆补体表达水平;利用ROC诊断试验寻找最佳cut-off值,进一步采用Kaplan-Meier曲线分析cut-off值组间在随访期间心血管不良事件的发生率差别(log rank检验计算组间差异显著性)研究结果ARVC患者年龄与正常对照相匹配(38.59±1.62VS.42.57±1.72),ARVC患者外周血中 sC5b9(314.28±19.11 VS.244.92±10.97 VS.221.43±33.96,P=0.004),thrombin(301.1±86.47 VS 15.62±4.95 VS.87.13±21.55,P=0.001)显著高于正常对照和 DCM 患者。DCM作为心力衰竭阳性对照,说明外周血中补体和凝血因子在ARVC患者中特异性表达升高。基于Spearman’s相关性分析,外周血浆补体sC5b9浓度与ARVC患者基线主要心律失常事件(MACE)以及房颤发生率显著相关(sC5b9～MACE at baseline,P=0.033;sC5b9～AF(ρ=0.457,P=0.001))。sC5b9 浓度与左室射血分数(LVEF,ρ=-0.306,P=0.004)以及右室射血分数(RVEF,ρ=-0.300,P=0.045)呈现出负相关趋势,而且 sC5b9 随着右心室内径扩张(RV ESV,ρ=0.336,P=0.024;RVID,ρ=0.427,P<0.001)而表达增加,说明sC5b9与ARVC患者心室收缩功能和组织结构重塑过程相关。对上述ARVC患者进行平均17.30±9.51 months(Mean±SD)的临床随访,21例ARVC患者发生不良事件:15例心脏移植、5例死亡、1例进入心脏移植等待名单。发生不良事件的ARVC患者血浆补体因子浓度显著高于未发生患者:sC5b9(434.55±32.17 VS.276.01±21.02,P<0.001)。基于 ROC 发现的 cutoff 值将患者分组,利用Kaplan-Meier曲线分析发现组间具有显著差异(sC5b9=356ng/ml,Log Rank P=0.0036)。研究结论血浆中补体可作为ARVC患者临床症状严重程度(心律失常、心室收缩功能以及结构重塑程度)和临床预后风险的生物标志物。