香蕉是继水稻、小麦和玉米之后的世界第四大粮食作物,我国是香蕉的重要生产国之一。但目前香蕉产业普遍遭受多种病虫害的严重威胁,其中由尖孢镰刀菌引起的香蕉枯萎病4号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race4)能侵染绝大多数香蕉栽培种尤其是具有高经济效益的Cavendish系香蕉,已经成为全球香蕉毁灭性的病害。培育抗枯萎病且具有高经济效益的香蕉新种是目前香蕉产业持续发展的重要出路。然而大多数栽培蕉均为不育的三倍体,难于利用传统杂交育种方式对其进行种质改良。而采用生物技术如体细胞杂交等有望可解决香蕉产业面临的问题。建立高效完善的香蕉胚性细胞悬浮系(Embryogenic cellsuspensions,ECS)是进行香蕉生物技术育种的前提和关键。　　 目前的文献报道中,未成熟雄花序或雌花序的培养是最常用且重复性较好的一种方法,通过此途径已经建立多个香蕉品种的ECS。但该方法具有品种和基因型依赖性,对于我国主栽品种中高抗枯萎病4号生理小种的大蕉(Musa.ABBparadisiaca Linn.cv.Dajiao)以及深受大众欢迎但易感枯萎病的巴西蕉(MusaAAA Cavendish cv.Baxijiao),均未有成功建立ECS的报道。本论文即采用未成熟雄花序培养法先后建立了大蕉和巴西蕉ECS,随后以ECS为材料进行巴西蕉原生质体分离和培养的研究,并在此基础上采用PEG法对大蕉和巴西蕉原生质体进行不对称融合及培养的研究,主要结果如下:　　 大蕉ECS及其经体胚发生途径植株再生体系的建立:大蕉未成熟雄花序诱导出的黄色小颗粒状胚性愈伤组织在液体培养基M2中启动悬浮培养,经4-5个月持续的筛选继代逐渐形成稳定均质的大蕉ECS。刚建成的大蕉ECS在体胚诱导培养基M3中约20 d即出现白色的球形胚,直径为154-900μm的悬浮细胞团在植板密度为0.4 mL20％SCV/皿(直径为9.5 cm)时可获得较高的体胚发生频率(2021±61个体胚/mL SCV)。大蕉ECS经长期的继代培养体胚发生能力明显下降,通过在不含2,4-D的培养基M2中预培养10 d并在体胚诱导培养基M3中添加1 mg/L ABA可使其体胚发生频率提高至对照的2.6倍。大蕉成熟体胚在萌发培养基M4中两周后即开始萌发(约23％),萌发后具微弱根系的小苗转至促根培养基MR中约一个月即获得健壮的小植株,植株转换率约为17％。　　 巴西蕉ECS及其经体胚发生途径植株再生体系的建立:从巴西蕉未成熟雄花序(1-12位花梳)诱导出四种外观和细胞形态各异的愈伤组织,其中浅黄色松散易碎、细胞近圆形且胞质丰富的愈伤组织确定为胚性愈伤组织。使用4 mg/L2,4-D可获得较高的胚性愈伤组织诱导率(约9.6％)。巴西蕉胚性愈伤组织在培养基M2中经3个月左右的筛选继代形成稳定的ECS。直径为154-900μm的悬浮细胞团在植板密度为0.4 mL20％SCV/皿(直径为9.5 cm)时体胚发生频率达到最高(25200±300个体胚/mL SCV)。在体胚培养基M3中添加1 mg/L的ABA可使体胚发生频率提高至对照的1.6倍,而2 mg/L的ABA.使体胚发生受到一定的抑制。巴西蕉成熟体胚在培养基M4中两周后开始萌发(约45％),萌发后具微弱根系的小苗转移至促根培养基MR中约一月即得到健壮的小植株(约38％)。　　 巴西蕉原生质体分离和培养的研究:继代培养第六天后过滤所得的小于200gm的悬浮细胞团在酶组合c(为2.0％纤维素酶R-10、0.5％离析酶R-10和0.15％果胶酶Y-23)的过夜(12 h)酶解下,可获得较高的原生质体产量(约为1.8×107个原生质体/mL PCV)。在看护培养过程中,采用龙芽蕉ECS为看护细胞时原生质体的分裂频率及看护培养一月后可见细胞团的形成率均达到最高,分别为32％和5.4％；其次是以贡蕉和巴西蕉ECS为看护细胞,分别为27％、3.8％和13％、0.9％；而以大蕉ECS为看护细胞时,仅观察到少数原生质体(约5％)的分裂且无法进一步发育成可见细胞团。同时在我们的实验过程中发现龙芽蕉、贡蕉、巴西蕉和大蕉ECS的体胚发生能力依次减弱,表明看护细胞的看护效果与其自身体胚发生能力的强弱成正相关。巴西蕉原生质体再生细胞团在体胚诱导培养基M3a中两个月后开始出现白色体胚(1072±136个/106个原生质体)；将M3a中的植物生长调节物质(Plant growth regulators,PGR)IAA和BAP的含量同时减半或完全去除,体胚发生频率可分别提高为对照的1.7和2.4倍。但这些体胚在进一步继代培养中逐渐褐化或愈伤化,未能获得巴西蕉原生质体的再生植株。　　 PEG诱导大蕉和巴西蕉原生质体不对称融合的研究:以强度为380μW/cm2的紫外线(Ultraviolet,UV)照射处理的大蕉原生质体为供体,以碘乙酰胺(Iodoacetamide,IOA)处理的巴西蕉原生质体为受体。结果表明UV照射60 s以上可显著抑制供体的细胞分裂,IOA处理浓度为2.5 mM可显著抑制受体的细胞分裂:采用30％的PEG可诱导形成较高的双融合率(约12.8％)。UV照射供体60、90、120 s再分别与2.5 mM IOA处理的受体进行融合,三种融合组合的产物形成可见细胞团所需的时间分别为22、28和35 d,在看护培养45 d后各自再生细胞团的形成率依次为421±33、968±87和647±62个/106个原生质体。这些再生细胞团转至培养基M3c中最后总共获得了1236个体胚,但它们在进一步继代培养中亦逐渐褐化或愈伤化,未能获得融合产物的再生植株。