农药2,4-D免疫检测方法的研究

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本论文制备了能够特异性识别2,4-D的多克隆抗体,并应用其建立了用于食品和水中2,4-D检测的酶联免疫分析方法(ELISA)和胶体金免疫层析法(GICA)。  以2,4-D和2,4-二氯苯氧乙酰胺丁酸为半抗原采用碳化二亚胺法制备四种人工免疫原免疫新西兰大白兔获得抗2,4-D多克隆抗体。经抗体效价及抑制率的比较最终选择2,4-D-BSA为免疫原免疫得到的抗体。本研究建立的2,4-D酶联免疫分析方法包括直接竞争酶联免疫法,间接竞争酶联免疫法。直接竞争酶联免疫法以2,4-二氯苯氧乙酰胺丁酸-HRP为酶标抗原,经优化缓冲液pH、离子强度以及封闭液等各个条件,最终建立高灵敏度的检测方法。此方法的灵敏度(IC50)为45.58±3.02μg/L,检出限(IC15)为1.58±0.11μg/L。间接竞争酶联免疫法以混合酸酐法合成的2,4-二氯苯氧乙酰胺丁酸-OVA为包被原,优化条件同直接竞争酶联免疫法,该方法的灵敏度(IC50)为78.37±4.58μg/L,检出限(IC15)为2.69±0.05μg/L。由于直接法比间接法灵敏度高且检出限低,因此选择直接法进行白菜、大麦、橙子等实际食品样品中2,4-D检测的研究。实验结果表明,应用PBS稀释的方法可以有效地消除基质影响,2,4-D在白菜、大麦、橙子中的平均回收率在81.24-114.80%之间。  胶体金免疫层析方法是采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为20 nm胶体金,经过优化确定胶体金连接金标抗体最适pH为6.5,偶联的抗体量为20μL,以0.1% OVA/PBS为封闭液封闭硝酸纤维素膜,最终该方法的检出限为100μg/L。以该方法检测食品样品和水样,其中食品样品通过用PBST稀释来消除基质影响,水样直接过0.22μm水膜来消除基质影响,最终食品样品的检出限为500μg/kg,水样的检出限为100μg/L。  本研究建立的2,4-D免疫学快速检测方法耗时短、灵敏度高、特异性强,适合对农业及环境的农药残留检测。
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