第一部分不同胎龄人胚胎神经干细胞的分离、培养、纯化及鉴定 研究背景与目的： 神经干细胞(neuralstemcell，NSC)是近来神经科学领域的研究热点之一，研究显示移植神经干细胞在治疗急、慢性神经系统损伤以及多种神经系统疾病如多发性硬化症、Alzheimer症、Parkinson病、Huntington症、缺血性脑损伤方面具有广阔的临床应用前景…。但是不论是现阶段的基础研究还是将来的临床应用都需要大量的神经干细胞，所以对神经干细胞的分离、培养、分化都是现阶段急需要解决的问题。建立稳定、可靠的神经干细胞体外培养模式，是探索其增殖、分化机理和进行神经干细胞体内移植的基础。本研究旨在获得不同胎龄的人胚胎NSC，通过培养了解其生物学特性，为深入研究其增殖、分化机理奠定基础。 方法： 1．从3～6周的人胚胎大脑皮层和神经管组织中以及7～18周的人胚胎大脑皮层中分离、培养及纯化原代人胚胎NSC。按不同的基础培养液分为2组：N2组和B27组，在体外反复传代培养以获得纯化的、能在体外长期生存的NSC。 2．NSC的鉴定：①单细胞克隆实验检测其自我更新能力；②免疫细胞化学检测NSC特征性标志nestin的表达；③GFAP、NF200、Gal-C免疫细胞化学检测其多向分化能力。 3．神经球计数检测不同培养基对NSC的增生的影响，研究其生长特点。 结果： 1．从3～6周流产人胚胎大脑皮层和神经管组织中以及7～l8周的人胚胎大脑皮层中均分离获得了可在体外生存的细胞。采用悬浮细胞培养法，细胞能够长期在体外生存并增殖。 2．经生长特征、形态学、免疫细胞化学等方法鉴定，结果显示，培养的细胞在生长方式、形态结构、功能特征、表面标志等方面，均具有典型NSC的生物学特征。 3．神经球计数提示人胚胎NSC在B27培养基体外培养体系中增生情况显著优于N2培养基体外培养体系(P<0．01)。 结论： 从3～18周人胚胎大脑皮层和3～6周人胚胎神经管组织中均成功分离得到了能在体外长期生存并增殖的细胞，经体外培养及鉴定证明：该类细胞为人胚胎NSC，具有自我更新增殖能力及向神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞分化的潜能。人胚胎NSC在B27培养基体外培养体系中增生情况显著优于N2培养基体外培养体系。 第二部分不同胎龄人神经干细胞的增殖及诱导分化为神经细胞的研究 研究背景与目的： 神经干细胞具有自我更新和多向分化潜能，在适宜的微环境的调控下能够增殖并分化成神经细胞、星型胶质细胞和少突胶质细胞。如果能通过体外培养获得大量NSC，并诱导其分化成神经细胞，就可以为中枢神经系统损伤后的再生和功能重建提供细胞移植来源。对治疗因神经细胞功能缺损而导致的脑血管病后遗症、神经系统退行性病f如Alzheimer病，Parkinson病)等具有重大意义。不同胎龄来源的人神经干细胞在增殖、分化潜能上是否存在差异，是否应该选择不同胎龄来源的人神经干细胞用于不同的临床疾病的治疗，是临床应用神经干细胞前希望解决的问题。本研究在成功分离、培养不同胎龄人胚胎神经干细胞的基础上对其增殖和分化规律进行了比较，希望能为治疗不同类型的中枢神经系统疾病，选择更加恰当的神经干细胞积累实验数据。 方法： 1．无菌条件下取3～18周的流产人胚胎，按胎龄大小分为3组：A组(3～6周)，B组(7～¨周)，C组(12～18周)，分离NSC，各组进行原代培养后进行纯化，培养过程中观察NSC的生长，计数神经球的数目以及直径检测其生长情况。 2．取不同胎龄组第2代NSC，接种于6孔板中，贴壁培养2天后按培养液不同分为联合组(bFGF+EGF+5％FCS+l％B27)，因子组(bFGF+EGF+l％B27)，血清组(5％FCS)，对照组(D／F12+1％B27)进行诱导分化，培养第12天时终止诱导，观察NSC生长及分化情况，经免疫细胞化学(ICC)检测细胞NF200的表达，统计阳性率，分析不同分化液对NSC定向诱导为神经细胞的作用，筛选出最佳分化作用的培养液。 3．取不同胎龄组培养的第2代NSC，接种于6孔板中，贴壁培养2天后更换培养液为最佳分化作用的培养液，培养第12天时终止诱导，观察生长、迁移、分化并形成神经网络雏形的情况，并统计分化细胞表达NF200的阳性率。 结果： 1．在B27体外培养体系中，3～6周胎龄组人胚胎NSC的神经球数目明显多于7～18周胎龄组人胚胎NSC的神经球数目(P<0．01)；3～6周胎龄组人胚胎NSC的直径明显大于7～18周胎龄组人胚胎NSC的的直径(P<0．01)。 2．在联合组、因子组、血清组、对照组培养液中均可见NSC的生长和分化，而因子组培养液更有利于NSC分化为神经细胞(P<0．01)。 3．各胎龄组NSC定向分化为神经细胞的比例存在明显差异，3～6周胎龄组NSC分化为神经细胞的比例显著高于7～18胎龄组(P<0．01)。 结论： 因子组培养液能定向诱导分化人胚胎NSC为神经细胞；3～18周胎 龄组人胚胎NSC的增殖和分化能力存在显著差异性，3～18周胎龄组NSC的增殖、分化能力均随胎龄的增加而逐步减弱；3～6周胎龄组NSC分化为的部分神经细胞更容易形成神经网络的雏形。