根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是革兰氏阴性土壤细菌,它可以感染植物的受伤部位,在大多数双子叶植物中均可导致冠缨瘤的产生。根癌农杆菌C58是根癌农杆菌的野生型菌株,它的基因组为5.67M,包括四部分,分别为一个环状染色体,一个线状染色体,两个质粒(pAtC58和pTiC58)。其中Ti质粒编码毒性因子和转移DNA(T-DNA)。T-DNA区域内的基因可以被任何DNA序列代替,使得它对基因转移研究,植物基因功能研究以及农作物转基因育种等方面都具有极其重要的意义。为了更好地利用根癌农杆菌的基因转移功能,需要对其进行深入的基因功能研究,并在此基础上进行遗传改造。2014年ShengBiao Hu等人将λRed重组系统应用于根癌农杆菌,成功对Ti质粒和线性染色体进行了修饰,但是重组效率并不理想。本研究旨在以Red/ET重组工程原理为基础,应用根癌农杆菌自身噬菌体的重组酶在根癌农杆菌C58和EHA105中建立和优化新型基因重组系统,以便高效快捷地对其进行遗传操作。筛选根癌农杆菌中的诱导型启动子。本研究通过构建一系列含有报告基因的表达质粒,来检测在根癌农杆菌C58和EHA105中的最佳诱导型启动子。其中绿色荧光蛋白用来直观定性,荧光素酶用于精确定量。实验结果表明,四环素诱导启动子(Ptet)是根癌农杆菌C58和EHA105中最为严谨的启动子,可以使重组酶只在需要表达时启动表达,从而提高了重组系统的稳定性。该诱导型启动子报告系统,为其它革兰氏阴性菌重组系统的开发,建立了良好的基础。以Red/ET重组工程原理为基础,构建一系列同源重组系统。在农杆菌、根瘤菌及其噬菌体基因组中搜索与来自于大肠杆菌λ噬菌体的Redα/Redβ或来源于大肠杆菌Rac前噬菌体的RecE/RecT具有相似功能的同源蛋白。NCBI Blast结果显示有4个理想的操纵子,它们既包含5’-3’的核酸外切酶又包含单链退火蛋白,以这4个操纵子为基础构建一系列重组酶表达质粒。不同同源重组系统的效率比较,并选择最佳的重组系统对两种根癌农杆菌的基因组进行修饰。将构建成功的一系列重组酶表达质粒转入到根癌农杆菌C58和EHA105中,并通过电转化具有80bp同源臂以及抗性筛选标记的PCR产物修饰表达质粒,比较一系列同源重组系统的重组效率。实验结果表明,在根癌农杆菌中,redγ或pluγ的表达能明显提高以上4种同源重组系统获得重组子的正确率。利用新开发的重组系统,成功对根癌农杆菌C58和EHA105的基因组进行了遗传修饰。建立的四个同源重组系统,有三个来源于根瘤菌的噬菌体,通过重组效率的比较和实验流程优化,也可以为根瘤菌开发高效的基因修饰技术。本研究在根癌农杆菌中建立起了新型同源重组系统,通过比较和优化,为高效便捷地修饰根癌农杆菌的基因组建立了更为理想的技术平台。通过新型同源重组系统的应用,将进一步加深对根癌农杆菌基因功能的研究,更好地利用根癌农杆菌作为植物转基因载体。