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目的:纳米氧化锌广泛应用于生物医药领域,其颗粒引起的神经毒性越来越得到重视。本研究以SH-SY5Y为细胞模型,通过比较三种不同粒径的纳米氧化锌(10 nm、50 nm、100 nm)的细胞毒性差异,选取毒性最大的50 nm纳米氧化锌用作后续的毒性机制研究,采用多种分子生物学技术,对自噬和线粒体自噬在纳米氧化锌诱导的细胞毒性机制中是否参与以及起何种作用进行了初步探讨,并进一步研究纳米氧化锌的毒性作用机制,以期为纳米氧化锌的生物安全性研究提供一定的理论依据。方法:1.通过CCK-8法、LDH释放实验检测纳米氧化锌对SH-SY5Y细胞的毒性作用。利用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况。Western blot观察纳米氧化锌对SH-SY5Y细胞caspase9、caspase3、bcl-2、bax蛋白表达水平的影响。2.通过免疫荧光法观察纳米氧化锌对SH-SY5Y细胞LC3蛋白表达的影响。Western blot观察纳米氧化锌对SH-SY5Y细胞P62、LC3、Beclin 1等自噬相关蛋白表达水平的影响。通过CCK-8、流式观察自噬抑制剂3-MA、自噬激动剂雷帕霉素对纳米氧化锌诱导SH-SY5Y细胞毒性及凋亡的影响。3.通过NAO荧光法、实时荧光定量PCR、流式细胞术、Western blot检测纳米氧化锌对SH-SY5Y细胞线粒体的影响。通过免疫荧光法观察纳米氧化锌作用下线粒体自噬体的变化、线粒体自噬溶酶体的变化及PINK1蛋白表达的影响。Western blot检测细胞总蛋白、胞浆和线粒体蛋白中PINK1、Parkin表达的变化。CCK-8、流式观察线粒体自噬抑制剂CsA对纳米氧化锌诱导SH-SY5Y细胞毒性及凋亡的影响。NAO染色、ROS检测CsA对纳米氧化锌诱导SH-SY5Y细胞线粒体损伤的影响。结果:1.10 nm、50 nm、100 nm的纳米氧化锌均对SH-SY5Y细胞有明显的细胞毒性,其中50 nm纳米氧化锌毒性最大,且呈一定量的剂量依赖性;纳米氧化锌可上调细胞内cleaved caspase3、cleaved caspase9和bax的表达,同时下调细胞内bcl-2的表达水平,流式结果显示纳米氧化锌可诱导细胞发生凋亡。2.纳米氧化锌可使细胞内P62蛋白表达下调,LC3 II/LC3 I的比值升高,同时上调Beclin 1的表达;免疫荧光图显示纳米氧化锌处理后荧光标记的LC3 II蛋白表达升高,荧光强度增强;纳米氧化锌与自噬抑制剂3-MA联合使用后,纳米氧化锌造成的细胞毒性增加,细胞凋亡率升高;纳米氧化锌与自噬激动剂雷帕霉素共同处理细胞后,纳米氧化锌造成的细胞毒性降低,细胞凋亡率下降。3.纳米氧化锌可造成SH-SY5Y细胞内线粒体质量下降、线粒体呼吸链复合体IV蛋白表达下调、线粒体编码的基因MT-CO2和MT-CO3表达下降、细胞内ROS水平升高。免疫荧光结果显示纳米氧化锌处理后LC3蛋白可与Mito-Tracker Green标记的线粒体共定位,线粒体能与Lyso-Tracker Red标记的溶酶体共定位;纳米氧化锌可使细胞内PINK1蛋白表达升高、胞浆内Parkin表达下调、线粒体内Parkin表达上调,总Parkin基本不变;线粒体自噬抑制剂CsA与纳米氧化锌的共处理可使纳米氧化锌造成的细胞毒性增加,细胞的凋亡率升高;CsA处理后能增加纳米氧化锌造成的线粒体质量下降和细胞内ROS水平的上升。结论:1.10 nm、50 nm、100 nm的纳米氧化锌均可导致SH-SY5Y细胞的毒性作用,其中50 nm纳米氧化锌毒性最大,实验结果发现,纳米氧化锌可诱导SH-SY5Y细胞激活线粒体途径的凋亡而引起细胞死亡。2.纳米氧化锌可诱导SH-SY5Y细胞发生自噬及PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。3.自噬和PINK1/Parkin介导的线粒体自噬是SH-SY5Y细胞抵御纳米氧化锌造成的细胞毒性的保护机制之一,提示我们可以通过自噬诱导剂来减少纳米氧化锌造成的神经毒性。