背景和目的人类细胞中基因组DNA不断受到内源性和环境因素的损伤。内源性因子如细胞代谢中间产物及毒素、环境因素包括紫外线、化学毒物等都可导致DNA损伤。DNA损伤后,首先通过对损伤的感知(sensors)和识别,经过某种信号转导,产生以下效应:DNA修复;旁路复制以及凋亡(apoptosis)。DNA修复是维持细胞遗传稳定性和高保真性的重要机制。如果DNA修复发生改变,将导致损伤的DNA不能修复或不能正确修复从而发生突变,突变的的发生将最终导致许多遗传性疾病的产生和癌症的发生(carcinogenesis)。根据DNA损伤的性质,DNA修复途径可分为:(1)碱基切除修复;(2)核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER);(3)错配修复;(4)重组修复。在众多的DNA修复途径和机制中,NER是主要的修复途径,能够修复大量的DNA损伤,所以NER在维持基因组稳定性和高保真性方面发挥着重要作用。NER有两个分途径:即基因组修复(Global Genome Repair GGR)和转录偶联修复(Transcription-Coupled Repair,TCR)。GGR参与基因组任何序列损伤的修复,对于阻止癌症的发生具有重要作用。TCR修复具有转录活性基因转录链上的DNA损伤,其主要作用是延缓衰老过程。这两个NER分途径都有四个步骤:(1)损伤识别和剪切复合体的聚集;(2)螺旋双链解旋;(3)损伤切除;(4)DNA修复合成以及双链连接;其中DNA损伤识别最为重要,只有损伤的DNA被识别后,后续修复过程才能启动。XPC(xeroderma pigmentosum gene group C,XPC)蛋白与hHR23B结合,在GGR过程中发挥着识别作用;而XPA (xeroderma pigmentosum gene group A,XPA)在GGR和TCR途径的交叉位点发挥作用,没有XPA的参与,GGR和TCR都不能够发生(如图一)。XPC最初从着色性干皮病(xeroderma pigmentosum,XP)发现的,作为一种常染色体隐性遗传病,着色性干皮病的最主要特征是患者皮肤对阳光敏感并可在幼年发展为疡。随后几乎90%的病人会在十多岁发生基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤等皮肤癌。在紫外线作用下,XP患者罹患皮肤癌的机率显著高于正常,约为正常人的2000倍。C1eaver等首先发现该病是由于患者对紫外线照射造成的核苷酸损伤切除修复缺陷所致。随着研究的深入,到目前已有7组互补型及一种XP变异型被发现,与之相对应的基因分别被命名为XPA、XPB、XPC、XPD、XPE、XPF、XPG和XPV。XPC基因由15个外显子组成,约17kb大小,定位于3p25。XPC蛋白存在于细胞核中,有证据显示,XPC蛋白可与hHR23B基因的表达产物紧密结合形成一个异二聚体,在GGR途径中起着DNA识别的作用。有研究表明,XPC在肺癌中低表达,并且低表达的XPC与肺癌的发生具有一定的联系。我们以前的研究发现,XPC在膀胱癌细胞株HT1197中低表达。同时有研究发现,xpc-/-小鼠中,膀胱癌的发生率升高。然而,对于XPC在膀胱癌组织中的表达,目前尚不明确。XPA在NER过程中发挥着不可替代的作用,xpa-/-小鼠体内没有NER机制。XPA基因含六个外显子,不同的外显子编码不同的氨基酸结构。其中E1编码与RPA34结合结构,E2编码与ERCC1结合结构,E3编码锌指结构,E4和E5编码loop-rich subdomain,与DNA结合,E6编码TFIIH结构。其中任何一个结构变异,都将导致NER机制效率降低甚至不能发生[10]。UV照射xpa-/-小鼠后发现,其各种癌症(包括膀胱癌)发生率比正常小鼠明显升高[18]。由此可以推测,XPA基因的表达状况,在膀胱癌发生方面,具有一定的影响。膀胱癌是泌尿系统高发性肿瘤,其中膀胱移行细胞癌占90%。膀胱癌的致病因素主要有:吸烟,工业相关的胺类以及人体摄入的某些药物。由于膀胱为空去腔型器官,膀胱粘膜长期暴露于尿液当中,尿液中的各种物质不断的造成DNA损伤,因此DNA修复对于膀胱癌来说至关重要。由于NER机制能够修复大量的DNA损伤,对于保持细胞遗传物质的稳定性具有重要作用因此,研究NER机制在膀胱癌中作用,可能为膀胱癌的防治提供新的线索。鉴于XPC、XPA在NER机制中的重要作用,本课题采用了Real-time PCR法比较膀胱癌组织与正常膀胱组织中XPC,XPA基因在RNA水平表达的差异性。Real-time PCR是一种高效敏感的mRNA检测方法,其准确性和特异性比以往的Northern等检测mRNA的方法有很大的提高。为检测XPC、XPA蛋白在膀胱癌组织中的表达,本课题还采用Western Blot比较膀胱癌组织与正常膀胱组织中XPC、XPA在蛋白水平的差异。此外,本课题中还用顺铂诱导膀胱癌细胞株BIU-87,5637,Real-time PCR检测分析顺铂处理前后膀胱癌细胞株中XPC、XPA的表达,对XPC、XPA与膀胱癌耐药性之间的关系,做了初步研究。方法XPC、XPA在膀胱癌组织中的表达。取西南医院泌尿外科手术切除标本(27例膀胱癌),液氮冰冻保存。提取膀胱癌组织和正常组织中RNA,Real-time PCR法比较XPC、XPA的表达;提取组织中总蛋白,Western Blot检测XPC、XPA蛋白表达。膀胱癌耐药性与NER基因XPC、XPA的关系。培养膀胱癌细胞株BIU-87,5367,用化疗药物顺铂刺激细胞株之后,提取细胞中RNA,检测XPC、XPA的表达,与未用顺铂处理的BIU87,5367细胞株中XPC、XPA表达作比较。结果成功提取膀胱癌组织中RNA,并建立Real-time定量PCR反应条件体系:在采用real-time定量PCR法检测基因表达之前,首先要建立定量PCR的反应条件,使反应的扩增效率在90~110%之间,同时所设计的real-timePCR引物必需具有扩增特异性。采用Real-time PCR检测了膀胱癌与膀胱组织中XPC、XPA的表达差异,膀胱癌中XPC、XPA表达明显低于正常膀胱组织(P<0.01)。此外,结合临床资料,我们发现化疗病人的膀胱癌组织中XPC、XPA的表达比没有经过化疗的膀胱癌组织中XPC、XPA的表达高(P<0.05)。成功提取了组织中的总蛋白,并采用western检测了膀胱癌组织以及膀胱组织中XPC、XPA蛋白表达,最终发现,膀胱癌中XPC、XPA蛋白的表达比正常膀胱组织中低(P<0.01)。成功培养BIU87、5637膀胱癌细胞株,并用化疗药物顺铂处理了其中一批细胞,之后,提取细胞中的RNA,比较药物处理前后XPC、XPA的表达差异性,最终发现,顺铂诱导后,膀胱癌细胞株BIU-87,5637的表达明显升高(P<0.01)。结论膀胱癌组织中XPC、XPA的在RNA水平的表达比正常膀胱组织中低,并且低表达的XPC、XPA基因与膀胱癌的发生具有一定的关系。化疗病人的膀胱癌组织中,XPC、XPA在RNA水平的表达升高,以及膀胱癌细胞株BIU-87和5637在经过顺铂诱导后,XPC、XPA的表达升高,这一结果初步说明了XPC、XPA参与了膀胱癌的耐药机制。