Exosome是由细胞多泡体外泌到细胞外的膜性小囊泡。他们参与了多种生理、病理过程,有望成为生物医学研究和应用开发的技术平台。但exosome的体积小,密度低,提取过程繁杂、产量也低,从而制约了对exosome的进一步研究。资料表明,exosome的外泌与胞内Ca²⁺浓度变化有一定关系。诱导Ca²⁺内流的Na⁺/H⁺交换剂（monensin）可促进K562细胞源性exosome的外泌。而Ca²⁺拮抗剂BAPTA-AM可抑制此过程。三氧化二砷,是砒霜的主要成分,对急性早幼粒细胞性白血病（APL）有较好疗效,也具有促进肝癌等多种肿瘤细胞凋亡的作用。同时有研究表明,三氧化二砷具有提高胞内Ca²⁺浓度的作用。结合这些特点本研究选用三氧化二砷作为干预因素,探讨小鼠肝癌细胞(H₂₂)源exosome外泌的变化。资料显示:膜融合机制——SNARE（soluble NSF attachment proteinreceptor）是解释神经内分泌细胞胞吐过程的机制之一。此过程受胞内Ca²⁺影响。exosome的生成与循环过程,与神经递质出入神经元的胞吐与胞吞过程类似,且exosome与神经内分泌囊泡在形态和大小上也非常接近。本研究拟检测小鼠肝癌细胞(H₂₂)在外泌exosome过程中有无SNARE相关蛋白的表达及表达变化。为进一步探讨和阐明exosome外泌机制奠定基础。另外,也观察exosome与三氧化二砷联合应用对小鼠皮下种植性肝癌模型的治疗效应。方法:1三氧化二砷对小鼠肝癌细胞(H₂₂)源exosome外泌的影响:用MTT法测定H₂₂细胞生长曲线,确定三氧化二砷对H₂₂细胞抑制率为10%的药物浓度,并确立H₂₂细胞源exosome提取的最佳收集细胞培养液时间;采用超速分级离心和蔗糖密度梯度离心法提取纯化exosome;利用Bradford法定量exosome总蛋白;借助荧光探针Fura-2和倒置荧光显微镜测Ca²⁺系统检测细胞胞内Ca²⁺的变化;采用免疫印迹法（Western blot）检测SNARE复合物相关蛋白——syntaxin。2三氧化二砷与小鼠肝癌细胞(H₂₂)源exosome联合应用对小鼠皮下种植性H₂₂肝癌模型的治疗性研究:小鼠皮下接种H₂₂细胞（5×10⁵个/只）后的第2天开始腹腔注射三氧化二砷,1次/天,连续10d。第4天开始皮下注射H₂₂源exosome,每隔4天一次,连续3次。观察各组肿瘤生长情况。于肿瘤细胞接种后第25天记录存活率,处死存活小鼠称取体重并解剖肿瘤称瘤重,计算肿瘤抑制率。免疫组织化学法检测各组肿瘤组织中CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞浸润情况。结果:1三氧化二砷对小鼠肝癌细胞(H₂₂)源exosome外泌的影响:1.1密度为5×10⁴个/ml的H₂₂细胞在培养的第24～48h生长最活跃,即为对数生长期。三氧化二砷对H₂₂细胞48h抑制率为10%的药物浓度是1.25μmol/L。从200ml H₂₂细胞上清液中可提取exosome 2ml。三氧化二砷实验组与对照组exosome总蛋白浓度分别为（0.96±0.10）mg/ml、（0.85±0.13）mg/ml（P＜0.05）。1.2倒置荧光显微镜测Ca²⁺系统显示,对照组H₂₂细胞胞内Ca²⁺相对浓度为0.58±0.04。用1.25μmol/L三氧化二砷的培养液培养6、12、24、48h后H₂₂细胞内Ca²⁺相对浓度分别为0.62±0.04、0.71±0.03、0.78±0.03、0.68±0.03（P＜0.05）。1.3 Western blot结果表明,用1.25μmol/L三氧化二砷的培养液培养12、24、48h后,H₂₂细胞表达syntaxin蛋白量增多。2三氧化二砷与小鼠肝癌细胞(H₂₂)源exosome联合应用对小鼠皮下种植性肝癌模型的治疗性研究:2.1小鼠皮下种植性肝癌(H₂₂)的生长情况:从小鼠皮下接种H₂₂细胞后第16天开始呈现出差异:两联合组、三氧化二砷组肿瘤的平均体积小于同一天对照组肿瘤的平均体积（P＜0.05）,也小于EXOn组、EXOa组肿瘤的平均体积（P＜0.05）;两联合组之间,联合组与三氧化二砷组之间无差异（P＞0.05）。从第20天起,联合组肿瘤的平均体积小于同一天三氧化二砷组肿瘤的平均体积（P＜0.05）,也小于对照组肿瘤的平均体积（P＜0.05）。两EXO组间及两联合组间肿瘤体积自始至终无差异（P＞0.05）。两EXO组与对照组自始至终无差异（P＞0.05）。2.2各组小鼠的存活率:小鼠皮下接种H₂₂肝癌细胞的第25天,对照组、三氧化二砷组、（三氧化二砷+EXOn）联合组、（三氧化二砷+EXOa）联合组、EXOn组、EXOa组小鼠的存活率分别为30%、50%、70%、80%、30%、30%。各组小鼠的生存率有差异,但是统计分析尚不能得出差异有统计学意义。2.3小鼠肝癌(H₂₂)的肿瘤抑制率:三氧化二砷组、（三氧化二砷+EXOn）联合组、（三氧化二砷+EXOa）联合组、EXOn组、EXOa组的肿瘤抑制率分别为44.58%、66.27%、65.06%、4.82%、6.03%。2.4肝癌(H₂₂)组织中CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞的浸润:对照组、三氧化二砷组、（三氧化二砷+EXOn）联合组、（三氧化二砷+EXOa）联合组、EXOn组、EXOa组肝癌组织中CD4⁺T淋巴细胞的平均光密度值分别为0.12±0.02、0.18±0.03、0.32±0.08、0.34±0.06、0.13±0.05、0.14±0.04。CD8⁺T淋巴细胞的平均光密度值分别为0.11±0.01、0.15±0.02、0.18±0.04、0.20±0.03、0.13±0.02、0.12±0.03。与对照组比较,两EXO组（EXOn、EXOa）无统计学差异（P＞0.05）;联合组、三氧化二砷组有统计学差异（P＜0.05）。与三氧化二砷组比较,联合组有统计学差异（P＜0.05）。两联合组之间、两EXO组之间无统计学差异（P＞0.05）。结论:1、低浓度三氧化二砷（1.25μmol/L）能够提高细胞内Ca²⁺浓度,促进syntaxin蛋白表达,促进小鼠肝癌细胞(H₂₂)exosome的分泌。说明小鼠肝癌细胞源exosome的外泌过程与神经内分泌胞吐过程相似。2、exosome与三氧化二砷对小鼠皮下H₂₂种植性肝癌模型有协同治疗效应,说明exosome在肿瘤的治疗方面也有一定作用。