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三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]为五加科人参属植物,其根、茎、花和剪口均可入药,具有止血、活血化瘀和防治心脑血管疾病等功效。三七皂苷为三七的主要药用活性成分,市场需求逐渐扩大,供需矛盾突出,加上三七对种植环境要求苛刻,生长周期长等特点阻碍了三七产业的可持续发展。由于三七皂苷为一些列结构复杂的四环三萜皂苷组成,化学合成较困难,因此通过研究三七皂苷生物合成途径,借助生物技术手段开展同源和异源方式合成皂苷,具有重要理论研究和实际应用价值。次生代谢物合成过程复杂,需通过一系列酶促反应完成。在三七皂苷合成途径中,通过控制转录因子的表达来实现对多个关键酶基因的调控是有效且可行的策略。转录因子能够作用于多个基因上游的启动子序列实现“多点调控”,影响与次生代谢产物合成相关的多个基因表达。本研究根据前期筛选获得的与茉莉酸甲酯应答元件JERE cis-element响应的PnMYB1转录因子基因3’端序列,设计特异性引物,借助RACE技术获得了PnMYB1基因全长。PnMYB1基因开放阅读框(ORF)长723 bp,编码240个氨基酸,相对分子量约为27.359 kDa,拥有典型的R2R3-MYB结构域。同源序列比对和系统进化树分析结果进一步表明转录因子PnMYB1属于R2R3-MYB类转录因子家族。PnMYB1融合绿色荧光蛋白(GFP)瞬时转染洋葱内表皮细胞,结果显示融合绿色荧光蛋白的转录因子PnMYB1蛋白定位于细胞核。将PnMYB1基因插入到植物表达载体pCAMBIA1300S,获得重组载体pCAMBIA1300S-PnMYB1,利用冻融法将重组载体导入农杆菌EHA105,再借助农杆菌介导法转染三七细胞。抗生素和分子检测手段筛选获得转PnMYB1基因的阳性三七细胞系。荧光定量PCR检测发现转PnMYB1基因三七细胞系中PnFPS和PnSE基因表达量明显提高,PnDS基因表达量也有一定的增加,PnSS和PnCAS基因表达量基本无变化。转PnMYB1基因三七细胞系中总皂苷含量约为对照组的1.73倍。Rl、Rgl、Re、Rbl和Rd这5种主要的单体皂苷含量也得到不同程度增加。为探究转录因子PnMYB1调控三七皂苷生物合成的机理,采用染色体步移技术克隆了三七中达玛烯二醇合酶基因(DS)、鲨烯合成酶基因(SS)和环阿屯醇合酶基因(CAS)5’端前面的部分启动子序列。根据克隆得到的启动子序列和已知的鲨烯环氧酶(SE)启动子序列设计特异性引物,获得了这些启动子的部分片段。克隆的启动子片段替换掉PBI121载体中的原有启动子序列,得到融合GUS基因的重组载体,并将重组载体导入农杆菌EHA105。将启动子片段单独转染和与转录因子PnMYB1共转染烟草叶片,检测GUS荧光活性。结果表明,发现共转染转录因子PnMYB1和PnSE1启动子片段的烟草叶片与单独转染PnSE1启动子片段的烟草叶片相比较,其GUS荧光活性得到明显提高。另外,启动子片段PnDSP1与PnMYB1基因共同转染的烟草叶片GUS荧光活性比单独转染PnDSP1启动子片段的烟草叶片强。启动子片段PnSS1和PnCAS1单独转染以及分别与PnMYB1基因共转染烟草叶片,其荧光活性无明显变化。以上研究表明,三七中过表达转录因子基因PnMYB1能够实现对皂苷合成途径的多点调控,促进皂苷合成,对三七皂苷生物合成途径的研究和认识具有重要意义,为同源和异源高效表达三七皂苷奠定了重要理论基础。