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目的:肺癌是严重危害人类生命与健康的重大疾病,其中非小细胞肺癌是最常见的病理类型.目前,铂类化疗药仍为治疗非小细胞肺癌的一线药物.但随着治疗周期的进行,肿瘤出现的耐药成为化疗失败的重要原因.探索铂类化疗药耐药产生的机制,对于改善非小细胞肺癌耐药、提高患者存活率意义重大.前期实验观察到,体外诱导的顺铂耐药的人肺腺癌细胞株A549/DDP高表达miR-222-3p,且miR-222-3p可通过A549分泌的外泌体释放到胞外,进而促进A549的继发耐药.另外,巨噬细胞是肿瘤微环境中重要的基质细胞,被称为肿瘤相关巨噬细胞(TAM).由于肿瘤微环境存在有利于M2型巨噬细胞分化因素,TAM一般为M2型巨噬细胞.M2细胞对肿瘤的生长、侵袭、转移起着关键作用.那么,对顺铂耐药的A549释放的富含miR-222-3p的外泌体,是否能够诱导巨噬细胞分化为M2型巨噬细胞,进而进一步促进激发耐药?为了探索巨噬细胞促进继发耐药的机制,本实验以肺腺癌细胞株A549为模型,建立miR-222-3p高表达细胞株A-222和敲低株sh-222/A,以及A-222的敲低株sh-222/A-222,观察上述细胞分泌的外泌体对人单核巨噬细胞株Thp-1的分化作用,进而分析经外泌体诱导后的Thp-1对A549耐药性的影响,从而探索miR-222-3p在A549发生顺铂耐药性中的作用.
方法:
1高通量分析人肺腺癌细胞株A549与耐受株A549/DDP释放的外泌体所携带的miRNAs
1.1外泌体的制备:收集人肺腺癌细胞株A549和耐受株A549/DDP的细胞上清液,差速离心(4℃,2000rpm离心10分钟取上清;4℃,3000rpm离心30分钟取上清;4℃11000rpm离心60分钟取上清:4℃,32000rpm离心16小时取沉淀)所得沉淀用适量PBS溶解然后用Nanodrop测其外泌体浓度.
1.2人肺腺癌细胞株A549与耐受株A549/DDP释放的外泌体中miRNA测序(委托上海康成生物有限公司采用IlluminaNextSeq方法进行).
2构建miR-222-3p稳定高表达细胞株A-222
体外培养A549细胞株,用携带miR-222-3p或scramble(阴性对照)的慢病毒感染,嘌呤霉素筛选出稳定高表达miR-222-3p的细胞株A-222细胞株;Real-timePCR检测A549及A-222中miR222-3p的表达水平.
3构建miR-222-3p稳定敲低细胞株sh-222/A-222和sh-222/A细胞株
体外培养A-222和A549细胞株,用携带miR-222-3p或sh-scramble(阴性对照)的慢病毒感染,用潮霉素筛选出稳定敲低miR-222-3p的细胞株sh-222/A-222和sh-222/A细胞株及阴性对照sh-c/A-222、sh-c/A;Real-timePCR检测A549、sh-c/A、sh-222/A、A-222、sh-c/A-222、sh-222/A-222细胞株中miR-222-3p的表达变化.
4比较A549、A-222、sh-222-/A-222与sh-222/A对顺铂的耐受、细胞增殖及迁移能力
4.1用含0μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml、50μg/ml、500μg/ml不同浓度顺铂的完全培养基分别作用于A549、sh-c/A、sh-222/A、A-222、sh-c/A-222、sh-222/A-222细胞株,48h后通过CCK实验检测IC50.
4.2用含6μg/ml顺铂的完全培养基处理A549、sh-c/A、sh-222/A、A-222、sh-c/A-222、sh-222/A-222细胞株48h,AnnexinV-PE和7-AAD染色,流式细胞术检测细胞凋亡率.
4.3通过Transwell实验、细胞划痕实验检测细胞迁移率;Westernblot检测细胞株N-Cadherin、E-Cadherin、Vimentin表达,分析A549、sh-c/A、sh-222/A、A-222、sh-c/A-222、sh-222/A-222细胞株的迁移.
4.4分析miR-222-3p对A549细胞株增殖、迁移相关的可能靶基因:Westernblot检测A549、sh-c/A、sh-222/A、A-222、sh-c/A-222、sh-222/A-222细胞株细中PTEN、P-AKT、AKT表达变化.
5观察不同细胞来源的外泌体A-exo、sh-c/A-exo、sh-222/A-exo、A-222-exo、sh-c/A-222-exo、sh-222/A-222-exo对人单核巨噬细胞株Thp-1分化诱导作用.
5.1利用差速离的心法提取以下细胞(A549、sh-c/A、sh-222/A、A-222、sh-c/A-222、sh-222/A-222)培养上清的外泌体,Nanodrop测其浓度.
5.2M0的诱导:体外培养Thp-1后用PMA(30μg/ml)诱导36h,此后用PBS清洗一遍,换成新鲜的含10%胎牛血清(FBS)的1640培养基,继续培养24h,贴壁的细胞即为M0.
5.3用含IL-4(20ng/ml)或1μg/ml脂多糖(LPS)+IFN-γ(20ng/ml)的完全培养基分别刺激M0(72h),分别做为M2和M1阳性对照;分别用含终浓度100μg/ml的不同外泌体(A-exo、sh-c/A-exo、sh-222/A-exo、A-222-exo、sh-c/A-222-exo、sh-222/A-222-exo)的完全培养基刺激M0(7d)为实验组.同时设PBS刺激M0的阴性对照.ELISA检测培养上清TNF-α、IL-1β和TGF-β1的水平.
6Thp-1的培养上清对A549继发耐药的作用:取5.3所得9种(包括阳性和阴性对照)M0的培养上清分别刺激A549细胞,72h后测其IC50.
结果:
1RNA测序结果显示,A549/DDP细胞株释放的外泌体携带miR-222-3p、miR-21-5p等多种miRNAs,其中miR-222-3p水平显著高于A549来源的外泌体(P<0.001).
2Real-timePCR结果显示,A-222与野生株A549比较,A-222细胞的miR-222-3p相对表达量明显增加(6.58±0.79倍,P<0.001).sh-222/A与A549比较,sh-222/A细胞的miR-222-3p相对表达量明显下降为(2.33±0.34倍,P<0.05).sh-222/A-222与A-222比较,sh-222/A-222细胞内miR-222-3p相对表达量明显下降为(1.79±0.98倍,P<0.05).
3CCK实验测定结果显示,A549及A-222细胞株对顺铂的IC50分别为19.38±3.17(μg/ml)和59.51±3.20(μg/ml),耐药指数为3.13±0.59,两株细胞对顺铂的IC50有明显的统计学差异(P<0.01).
同样,sh-c/A、sh-222/A细胞株对顺铂的IC50分别为15.92±3.20(μg/ml)和11.26±0.92(μg/ml),sh-222/A的IC50与A549、sh-c/A的IC50均明显降低(均P<0.01),而A549与sh-c/A对顺铂的敏感性没有明显的区别.
sh-222/A-222细胞株对顺铂的IC50为28.32±2.66(μg/ml),均低于A-222及其对照细胞株sh-c/A-222的59.51±3.20(μg/ml)和54.07±7.85(μg/ml),均有统计学差异(均P<0.01).
总之,敲低miR-222-3p后,可以明显提高肺腺癌A549细胞株对顺铂的敏感性.
4细胞凋亡结果显示,sh-222/A及sh-222/A-222低表达miR-222-3p的细胞株经6μg/mlDDP处理48h后,细胞凋亡率明显高于A549、sh-c/A、A-222及sh-c/A-222这些对照细胞株(均P<0.01).说明随着miR-222-3p水平的下降,细胞对顺铂诱导的凋亡敏感性增加.
5划痕实验结果显示,高表达miR-222-3p的A-222细胞株横向迁移率为57.5%±2.12%,明显高于其对照细胞株A549的横向迁移率22.5%±3.53%,二者差异有统计学意义(P<0.01).
敲低miR-222-3p的细胞株sh-222/A及sh-222/A-222的横向迁移明显受到抑制,二者的迁移率分别为9.0%±1.41%和31.5%±2.12%,均较其对照细胞的迁移率有明显降低(P<0.05及P<0.01).
6Transwell实验结果显示,高表达miR-222-3p的A-222细胞株纵向迁移的细胞数(用OD450表示)为1.41±0.05,明显多于其对照细胞株A549的纵向迁移细胞数0.36±0.33,二者差异有统计学意义(P<0.01).
敲低miR-222-3p的细胞株sh-222/A及sh-222/A-222的纵向迁移明显受到抑制,二者纵向迁移的细胞分别为0.11±0.012和0.75±0.03,均较其对照组A549、sh-c/A及A-222、sh-c/A-222迁移细胞数明显减少(P<0.05及P<0.01).
7WesternBlot结果表明,miR-222-3p高表达的细胞N-cadherin(蛋白中神经型钙黏蛋白)升高(P<0.05),而E-cadherin(上皮性钙黏蛋白)和vimentin(波形蛋白)改变无统计学差异.从而说明miR-222-3p的高表达可以促进细胞的迁移.
8WesternBlot结果进一步表明,miR-222-3p高表达的细胞中PTEN蛋白表达明显下降(P<0.01),p-AKT蛋白显著升高(P<0.01).说明PTEN可能是miR-222-3p的一个靶基因;miR-222-3p通过影响PTEN/pAkt信号分子的活性参与促进A549细胞对顺铂的耐受.
9用A549和A-222(高表达miR-222-3p)细胞分泌的外泌体A-exo和A-222-exo分别刺激PMA活化的Thp-1细胞后,经ELISA检测到培养上清的IL-1β、TGF-β1和TNF-α的水平,A-222-exo刺激组的IL-1β、TGF-β1均显著高于A-exo刺激组,而TNF-α的水平显著低于A-exo刺激组(均为P<0.05).
敲低miR-222-3p细胞(sh-222/A及sh-222/A-222)的外泌体sh-222/A-exo及sh-222/A-222-exo分别刺激PMA活化的Thp-1细胞后,ELISA检测到培养上清的IL-1β、TGF-β1和TNF-α的水平.sh-222/A-exo刺激组的IL-1β、TGF-β1均显著低于A-exo刺激组,而TNF-α的水平显著高于A-exo刺激组(均为P<0.05);sh-222/A-222-exo刺激组的IL-1β、TGF-β1均显著低于A-222-exo刺激组,而TNF-α的水平显著高于A-222-exo刺激组(均为P<0.05).说明miR-222-3p敲低后释放的外泌体有诱导巨噬细胞向M1分化的倾向.
10用A549和A-222(高表达miR-222-3p)细胞分泌的外泌体A-exo和A-222-exo,分别刺激PMA活化的Thp-1细胞,9d后,取其培养上清分别处理A54972h,CCK测定其对顺铂的IC50,结果表明miR222-3p高表达细胞株分泌的外泌体处理的Thp-1培养上清可显著提高A549对顺铂的耐受(P＜0.01);而经敲低miR-222-3p的肿瘤细胞释放的外泌体处理的Thp-1培养上清,可显著提高A549对顺铂的敏感性(P<0.01).
结论:
1miR-222-3p高表达可促进人肺腺癌A549细胞株对顺铂的耐受;
2高表达miR-222-3p的A-222细胞株可通过分泌的外泌体影响PMA活化的Thp-1的分化;
3高表达miR-222-3p的细胞释放的外泌体处理的Thp-1培养上清可促进A549对顺铂的耐受.
方法:
1高通量分析人肺腺癌细胞株A549与耐受株A549/DDP释放的外泌体所携带的miRNAs
1.1外泌体的制备:收集人肺腺癌细胞株A549和耐受株A549/DDP的细胞上清液,差速离心(4℃,2000rpm离心10分钟取上清;4℃,3000rpm离心30分钟取上清;4℃11000rpm离心60分钟取上清:4℃,32000rpm离心16小时取沉淀)所得沉淀用适量PBS溶解然后用Nanodrop测其外泌体浓度.
1.2人肺腺癌细胞株A549与耐受株A549/DDP释放的外泌体中miRNA测序(委托上海康成生物有限公司采用IlluminaNextSeq方法进行).
2构建miR-222-3p稳定高表达细胞株A-222
体外培养A549细胞株,用携带miR-222-3p或scramble(阴性对照)的慢病毒感染,嘌呤霉素筛选出稳定高表达miR-222-3p的细胞株A-222细胞株;Real-timePCR检测A549及A-222中miR222-3p的表达水平.
3构建miR-222-3p稳定敲低细胞株sh-222/A-222和sh-222/A细胞株
体外培养A-222和A549细胞株,用携带miR-222-3p或sh-scramble(阴性对照)的慢病毒感染,用潮霉素筛选出稳定敲低miR-222-3p的细胞株sh-222/A-222和sh-222/A细胞株及阴性对照sh-c/A-222、sh-c/A;Real-timePCR检测A549、sh-c/A、sh-222/A、A-222、sh-c/A-222、sh-222/A-222细胞株中miR-222-3p的表达变化.
4比较A549、A-222、sh-222-/A-222与sh-222/A对顺铂的耐受、细胞增殖及迁移能力
4.1用含0μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml、50μg/ml、500μg/ml不同浓度顺铂的完全培养基分别作用于A549、sh-c/A、sh-222/A、A-222、sh-c/A-222、sh-222/A-222细胞株,48h后通过CCK实验检测IC50.
4.2用含6μg/ml顺铂的完全培养基处理A549、sh-c/A、sh-222/A、A-222、sh-c/A-222、sh-222/A-222细胞株48h,AnnexinV-PE和7-AAD染色,流式细胞术检测细胞凋亡率.
4.3通过Transwell实验、细胞划痕实验检测细胞迁移率;Westernblot检测细胞株N-Cadherin、E-Cadherin、Vimentin表达,分析A549、sh-c/A、sh-222/A、A-222、sh-c/A-222、sh-222/A-222细胞株的迁移.
4.4分析miR-222-3p对A549细胞株增殖、迁移相关的可能靶基因:Westernblot检测A549、sh-c/A、sh-222/A、A-222、sh-c/A-222、sh-222/A-222细胞株细中PTEN、P-AKT、AKT表达变化.
5观察不同细胞来源的外泌体A-exo、sh-c/A-exo、sh-222/A-exo、A-222-exo、sh-c/A-222-exo、sh-222/A-222-exo对人单核巨噬细胞株Thp-1分化诱导作用.
5.1利用差速离的心法提取以下细胞(A549、sh-c/A、sh-222/A、A-222、sh-c/A-222、sh-222/A-222)培养上清的外泌体,Nanodrop测其浓度.
5.2M0的诱导:体外培养Thp-1后用PMA(30μg/ml)诱导36h,此后用PBS清洗一遍,换成新鲜的含10%胎牛血清(FBS)的1640培养基,继续培养24h,贴壁的细胞即为M0.
5.3用含IL-4(20ng/ml)或1μg/ml脂多糖(LPS)+IFN-γ(20ng/ml)的完全培养基分别刺激M0(72h),分别做为M2和M1阳性对照;分别用含终浓度100μg/ml的不同外泌体(A-exo、sh-c/A-exo、sh-222/A-exo、A-222-exo、sh-c/A-222-exo、sh-222/A-222-exo)的完全培养基刺激M0(7d)为实验组.同时设PBS刺激M0的阴性对照.ELISA检测培养上清TNF-α、IL-1β和TGF-β1的水平.
6Thp-1的培养上清对A549继发耐药的作用:取5.3所得9种(包括阳性和阴性对照)M0的培养上清分别刺激A549细胞,72h后测其IC50.
结果:
1RNA测序结果显示,A549/DDP细胞株释放的外泌体携带miR-222-3p、miR-21-5p等多种miRNAs,其中miR-222-3p水平显著高于A549来源的外泌体(P<0.001).
2Real-timePCR结果显示,A-222与野生株A549比较,A-222细胞的miR-222-3p相对表达量明显增加(6.58±0.79倍,P<0.001).sh-222/A与A549比较,sh-222/A细胞的miR-222-3p相对表达量明显下降为(2.33±0.34倍,P<0.05).sh-222/A-222与A-222比较,sh-222/A-222细胞内miR-222-3p相对表达量明显下降为(1.79±0.98倍,P<0.05).
3CCK实验测定结果显示,A549及A-222细胞株对顺铂的IC50分别为19.38±3.17(μg/ml)和59.51±3.20(μg/ml),耐药指数为3.13±0.59,两株细胞对顺铂的IC50有明显的统计学差异(P<0.01).
同样,sh-c/A、sh-222/A细胞株对顺铂的IC50分别为15.92±3.20(μg/ml)和11.26±0.92(μg/ml),sh-222/A的IC50与A549、sh-c/A的IC50均明显降低(均P<0.01),而A549与sh-c/A对顺铂的敏感性没有明显的区别.
sh-222/A-222细胞株对顺铂的IC50为28.32±2.66(μg/ml),均低于A-222及其对照细胞株sh-c/A-222的59.51±3.20(μg/ml)和54.07±7.85(μg/ml),均有统计学差异(均P<0.01).
总之,敲低miR-222-3p后,可以明显提高肺腺癌A549细胞株对顺铂的敏感性.
4细胞凋亡结果显示,sh-222/A及sh-222/A-222低表达miR-222-3p的细胞株经6μg/mlDDP处理48h后,细胞凋亡率明显高于A549、sh-c/A、A-222及sh-c/A-222这些对照细胞株(均P<0.01).说明随着miR-222-3p水平的下降,细胞对顺铂诱导的凋亡敏感性增加.
5划痕实验结果显示,高表达miR-222-3p的A-222细胞株横向迁移率为57.5%±2.12%,明显高于其对照细胞株A549的横向迁移率22.5%±3.53%,二者差异有统计学意义(P<0.01).
敲低miR-222-3p的细胞株sh-222/A及sh-222/A-222的横向迁移明显受到抑制,二者的迁移率分别为9.0%±1.41%和31.5%±2.12%,均较其对照细胞的迁移率有明显降低(P<0.05及P<0.01).
6Transwell实验结果显示,高表达miR-222-3p的A-222细胞株纵向迁移的细胞数(用OD450表示)为1.41±0.05,明显多于其对照细胞株A549的纵向迁移细胞数0.36±0.33,二者差异有统计学意义(P<0.01).
敲低miR-222-3p的细胞株sh-222/A及sh-222/A-222的纵向迁移明显受到抑制,二者纵向迁移的细胞分别为0.11±0.012和0.75±0.03,均较其对照组A549、sh-c/A及A-222、sh-c/A-222迁移细胞数明显减少(P<0.05及P<0.01).
7WesternBlot结果表明,miR-222-3p高表达的细胞N-cadherin(蛋白中神经型钙黏蛋白)升高(P<0.05),而E-cadherin(上皮性钙黏蛋白)和vimentin(波形蛋白)改变无统计学差异.从而说明miR-222-3p的高表达可以促进细胞的迁移.
8WesternBlot结果进一步表明,miR-222-3p高表达的细胞中PTEN蛋白表达明显下降(P<0.01),p-AKT蛋白显著升高(P<0.01).说明PTEN可能是miR-222-3p的一个靶基因;miR-222-3p通过影响PTEN/pAkt信号分子的活性参与促进A549细胞对顺铂的耐受.
9用A549和A-222(高表达miR-222-3p)细胞分泌的外泌体A-exo和A-222-exo分别刺激PMA活化的Thp-1细胞后,经ELISA检测到培养上清的IL-1β、TGF-β1和TNF-α的水平,A-222-exo刺激组的IL-1β、TGF-β1均显著高于A-exo刺激组,而TNF-α的水平显著低于A-exo刺激组(均为P<0.05).
敲低miR-222-3p细胞(sh-222/A及sh-222/A-222)的外泌体sh-222/A-exo及sh-222/A-222-exo分别刺激PMA活化的Thp-1细胞后,ELISA检测到培养上清的IL-1β、TGF-β1和TNF-α的水平.sh-222/A-exo刺激组的IL-1β、TGF-β1均显著低于A-exo刺激组,而TNF-α的水平显著高于A-exo刺激组(均为P<0.05);sh-222/A-222-exo刺激组的IL-1β、TGF-β1均显著低于A-222-exo刺激组,而TNF-α的水平显著高于A-222-exo刺激组(均为P<0.05).说明miR-222-3p敲低后释放的外泌体有诱导巨噬细胞向M1分化的倾向.
10用A549和A-222(高表达miR-222-3p)细胞分泌的外泌体A-exo和A-222-exo,分别刺激PMA活化的Thp-1细胞,9d后,取其培养上清分别处理A54972h,CCK测定其对顺铂的IC50,结果表明miR222-3p高表达细胞株分泌的外泌体处理的Thp-1培养上清可显著提高A549对顺铂的耐受(P＜0.01);而经敲低miR-222-3p的肿瘤细胞释放的外泌体处理的Thp-1培养上清,可显著提高A549对顺铂的敏感性(P<0.01).
结论:
1miR-222-3p高表达可促进人肺腺癌A549细胞株对顺铂的耐受;
2高表达miR-222-3p的A-222细胞株可通过分泌的外泌体影响PMA活化的Thp-1的分化;
3高表达miR-222-3p的细胞释放的外泌体处理的Thp-1培养上清可促进A549对顺铂的耐受.