本文为探讨猪Orexins及其受体的生物学功能，开展了五个方面的研究： 一、采用RACE结合RT-PCR方法，克隆了猪OX1R和OX2R的cDNA序列；在此基础上，采集7日龄仔猪各主要组织器官，采用RT-PCR方法检测了猪OX1R和OX2R mRNAs在各主要组织器官中的表达。结果表明：猪OX1R基因的cDNA序列全长1801bp(GenBank-DQ321701)，编码425个氨基酸残基，与人和大鼠OX1R的同源性分别为95.3％、91.3％；猪OX2R 基因的cDNA序列长1673bp(GenBank：DQ321702)，编码444个氨基酸残基，与人及大鼠OX2R的同源性分别为97.7％、91.8％。猪OX1R和OX2R mRNA在中枢神经系统的不同部位(下丘脑、大脑、小脑和脑干)均有较高水平表达，同样，两种受体在外周组织包括垂体、肺、肝脏、肾脏、胰腺、胃、回肠和睾丸等中也有广泛分布，但存在一定的差异：在脾脏、十二指肠和结肠等组织中只有OX2R mRNA表达，在心脏、空肠、肌肉和脂肪中两种受体均未见表达。 二、分别采集1、7、26、30、60、90和150日龄的长白和蓝塘两品种猪下丘脑和胃组织样品，采用实时荧光定量PCR方法，检测了猪Orexins、OX1R及OX2RmRNAs在上述组织中的表达。结果表明： (1)30d前，长白猪和蓝塘猪下丘脑Orexins mRNA的表达模式一致。表现为，在哺乳期(1d到26d)两品种猪表达量均逐渐升高，26d时均显著高于1d(P<0.05)，但30d时均显著下降(P<0.05)；30d后，两个品种猪表达模式有较大不同，表现为，长白猪在30d后逐渐升高，150d时达表达高峰，而蓝塘猪在60d时即显著高于30d(P<0.05)，且一直维持该表达水平至150d。除1d和30d外，在其它各发育阶段，长白猪下丘脑Orexins mRNA的表达水平均显著高于蓝塘猪(P<0.05)。 (2)长白猪和蓝塘猪下丘脑OX1R mRNA的发育性表达模式一致。表现为，在哺乳期，两品种猪下丘脑OX1R mRNA表达均无显著变化(P>0.05)，30d时，两个品种猪均显著下降(P<0.05)，随后逐渐升高，长白猪至150d时达到峰值，而蓝塘猪在90d时即达高峰，并维持至150d。两个品种间下丘脑OX1R mRNA的表达水平在不同发育阶段均无显著差异(P>0.05)。 (3)长白猪和蓝塘猪下丘脑OX2R mRNA的发育性表达模式一致。从整个发育阶段看，除在30d时两个品种猪下丘脑OX2R mRNA表达水平均显著下降(P<0.05)外，其余各阶段间表达量相对稳定(P>0.05)。两个品种间下丘脑OX2R mRNA的表达水平在不同发育阶段均无显著差异(P>0.05)。 (4)长白猪和蓝塘猪胃Orexins mRNA的发育性表达模式不同。长白猪胃OrexinsmRNA的表达在30d前无显著变化(P>0.05)，60d时显著升高(P<0.05)，至150d时达表达高峰；蓝塘猪在60d前无显著差异(P>0.05)，90d时显著升高(P<0.05)，并一直维持至150d。60d后，长白猪胃Orexins mRNA水平均显著高于蓝塘猪(P<0.05)。 (5)长白猪和蓝塘猪胃OX1R mRN,A的发育性表达模式一致。表现为，在30d前，胃OX1R mRNA无显著差异(P>0.05)，随后逐渐升高，至150d时达到表达高峰。从整个发育阶段看，除26d外，在其它各发育阶段长白猪胃OX1R mRNA的表达水平均显著高于蓝塘猪(P<0.05)。 (6)长白猪和蓝塘猪胃OX2R mRNA的发育性表达模式不同。长白猪胃OX2RmRNA的表达水平呈阶段性变化，表现为，30d前各阶段间差异不显著(P>0.05)，60d时显著升高(P<0.05)，并一直维持该水平至150d。蓝塘猪胃OX2R mRNA水平并不随发育阶段而改变。从整个发育阶段看，在小猪阶段(60d和90d)，长白猪胃OX2R mRNA的表达水平均显著高于蓝塘猪(P<0.05)。 三、采用冰冻切片结合免疫组织化学方法，检测了OX1R和OX2R在7日龄公仔猪下丘脑中的细胞定位。结果表明，在猪下丘脑腹内侧核、背内侧核、弓状核、室周核和室旁核内分布有OX1R和OX2R两种免疫阳性神经元，而在视交叉上核和下丘脑外侧区只存在OX1R免疫阳性神经元，在视前外侧核只存在OX2R免疫阳性神经元。 四、采用改良的Seglen原位两步灌流法分离了仔猪肝细胞。用OrexinA分别处理悬浮培养以及贴壁培养的肝细胞，检测肝细胞葡萄糖释放、分泌功能以及与糖脂代谢过程中关键酶基因的mRNA表达。结果表明： (1)100nM OrexinA处理10min后可以显著促进肝细胞葡萄糖的释放(P<0.05)。 (2)不同浓度(1nM～500nM)的OrexinA处理原代培养的仔猪肝细胞24h，均显著升高肝细胞培养上液清中的葡萄糖、白蛋白、总胆汁酸和总胆固醇的浓度(P<0.05)；500nM OrexinA处理显著升高甘油三酯的浓度(P<0.05)。 (3)不同浓度(1nM～500nM)OrexinA处理原代培养的仔猪肝细胞24h，呈剂量依赖性上调ACC、GT和PEPCK mRNAs的表达(P<0.05)；均显著上调OX1R mRNA的表达(P<0.05)。 五、采用RT-PCR扩增猪OX1R开放阅读框(ORF)，构建pcDNA-OX1R真核表达载体，由阳离子脂质体介导将peDNA-OX1R质粒转入CHO细胞，获得稳定表达OX1R的CHO-OX1R单克隆细胞，以CHO-OX1R全细胞作靶标，用噬菌体随机多肽库进行生物淘选OX1R激动剂。结果表明：以CHO-OX1R完整细胞作为靶标，对噬菌体展示随机7肽库进行多轮淘选，获得了2条与OX1R特异结合的序列，序列分析结果表明，这两个序列与OrexinA和OrexinB的同源性都非常低，且不与任何其它蛋白同源。