论文部分内容阅读
组织蛋白酶B(CTSB)和组织蛋白酶S(CTSS)为存在于溶酶体内的半胱氨酸蛋白酶,在细胞凋亡、卵母细胞成熟和胚胎附植等多种生理活动中发挥着重要作用。caspase 3处于caspase级联反应的下游,为细胞凋亡的执行者,其活化作为细胞凋亡早期的标志。研究这三种蛋白酶的活性和表达量在卵母细胞体外成熟过程中变化及与卵母细胞质量和发育能力的相关性,能反应卵母细胞在体外成熟过程中所受到凋亡刺激的强度,同时,研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64对卵母细胞内CTSB、CTSS和caspase 3活性和表达量的影响,则可为提高卵母细胞体外成熟质量和发育能力提供理论依据。对于不同来源(成年绵羊及羔羊)、不同质量的绵羊卵母细胞,利用RT-PCR检测在体外成熟(IVM)过程中CTSB、CTSS和caspase 3基因表达量,利用双夹心ELISA对CTSB、CTSS和caspase 3蛋白表达量和活性进行检测,结果表明:在IVM 24h时,质量正常的卵母细胞内CTSB、CTSS和caspase 3基因、蛋白表达量与活性均低于质量差的卵母细胞(P<0.05;P<0.01)。成年绵羊卵母细胞与羔羊卵母细胞相比,在IVM 24h时,成年绵羊卵母细胞内CTSB、CTSS和caspase 3基因和蛋白表达量及CTSB活性均低于羔羊卵母细胞(P<0.05;P<0.01)。成年绵羊及羔羊的卵母细胞在体外成熟过程中,CTSB、CTSS和caspase 3基因表达量的研究结果表明:在成年绵羊卵母细胞内,CTSB基因表达量保持稳定(P>0.05),成熟液中添加1μmol/L E-64和5μmol/L E-64对CTSB基因表达量无显著影响(P>0.05),添加10μmol/L E-64则使CTSB基因表达量极显著高于对照组(P<0.01);CTSS基因表达量在IVM 16h以前一直处于无法被检测到的水平,并且1、5和10μmol/L E-64对CTSS基因表达量均无显著影响(P>0.05);caspase 3基因表达量呈先降低后升高的趋势(P<0.05),1μmol/L E-64对caspase 3基因表达量无显著影响(P>0.05),5μmol/L E-64对基因表达起到下调作用(P<0.05),而10μmol/L E-64提高了卵母细胞内caspase基因表达量(P<0.05)。对于羔羊卵母细胞,CTSB基因表达量呈上升趋势(P<0.01),1μmol/L E-64和5μmol/L E-64显著或极显著降低了CTSB基因表达量(P<0.05;P<0.01),10μmol/L E-64则极显著促进了CTSB的基因表达(P<0.01);与成年绵羊卵母细胞不同,对照组CTSS基因在IVM 0h已经有所表达,IVM 24h时CTSS基因表达量极显著高于IVM 0h(P<0.01),1μmol/L E-64和5μmol/L E-64对CTSS基因表达量无显著影响(P>0.05),而10μmol/L E-64极显著促进了CTSS基因表达(P<0.01);caspase 3基因表达量变化与CTSS相似,不同之处是1μmol/L E-64和5μmol/L E-64组内caspase 3基因表达量均与IVM 0h无显著差异(P>0.05)。成年绵羊及羔羊的卵母细胞内CTSB、CTSS和caspase 3蛋白表达量和活性的结果表明:成年绵羊卵母细胞内,CTSB蛋白表达量和活性均保持稳定(P>0.05),5μmol/L E-64对CTSB蛋白表达量无显著影响(P>0.05),但在IVM 8h时CTSB活性显著降低(P<0.05),10μmol/L E-64使CTSB蛋白表达量上调(P<0.05),同时使CTSB活性降低(P<0.01);成年绵羊卵母细胞内CTSS蛋白表达量和活性在体外成熟过程中无显著变化(P>0.05),5μmol/L和10μmol/L E-64可不同程度地降低CTSS活性(P<0.05;P<0.01),而对CTSS蛋白表达量无显著影响(P>0.05);caspase 3蛋白表达量保持稳定(P>0.05),活性于IVM 8h降至最低点后(P<0.01),又于IVM16h升高至与IVM 0h和IVM 24h无显著差异的水平(P>0.05),5μmol/L和10μmol/L E-64分别在不同程度上降低了caspase 3活性(P<0.05;P<0.01),5μmol/L E-64对caspase 3蛋白表达量无显著影响(P>0.05),10μmol/L E-64组的caspase 3蛋白表达量升高(P<0.05)。羔羊卵母细胞内,CTSB蛋白表达量无显著变化(P>0.05),而活性呈上升趋势(P<0.01),5μmol/L E-64组的CTSB蛋白表达量极显著降低(P<0.01),对CTSB活性无显著影响(P>0.05),10μmol/L E-64组的CTSB蛋白表达极显著升高(P<0.01),并且CTSB活性显著降低(P<0.05);CTSS蛋白表达量和活性均无显著变化(P>0.05),5μmol/L E-64和10μmol/L E-64组的CTSS蛋白表达量发生不同程度降低(P<0.05;P<0.01),5μmol/L E-64组的CTSS活性极显著降低(P<0.01),而10μmol/L E-64组的CTSS活性无显著变化(P>0.05);caspase 3蛋白表达量和活性保持稳定(P>0.05),5μmol/L E-64组的caspase 3蛋白表达量和活性均降低(P<0.05),10μmol/L E-64组内caspase 3蛋白表达量和活性无显著变化(P>0.05)。