论文部分内容阅读
丝裂霉素C（MMC），是一种强力诱导活性氧生成的抗肿瘤药，主要用于治疗各种肿瘤。近年来发现其强大的预防硬膜外瘢痕粘连的作用，而成纤维细胞的过度增生是形成硬膜外瘢痕的主要原因。目的第一部分：体外培养人硬膜外瘢痕成纤维细胞，探讨MMC对人成纤维细胞的影响。第二部分：内质网应激在MMC诱导人成纤维细胞凋亡中的作用及机制研究。第三部分：活性氧（ROS）在内质网应激参与MMC诱导人成纤维细胞凋亡中的作用及机制研究。方法第一部分：1.原代培养人硬膜外瘢痕组织来源的成纤维细胞，并采用免疫细胞化学法行成纤维细胞鉴定。10mg粉状MMC溶于新鲜培养液中。含不同浓度MMC的培养液于每次实验前现配。2. CCK-8（Cell Counting Kit-8，细胞计数试剂盒-8）检测不同干预对成纤维细胞活性的影响。3.流式细胞分析技术检测细胞凋亡率和细胞周期。4. TUNEL法检测细胞凋亡。5. Western blot法检测Cleaved Caspase-3、PRAP、Cleaved PRAP的水平变化及活化情况。第二部分：1.获取人硬膜外瘢痕组织并原代培养，筛选出成纤维细胞，并行免疫细胞化学法鉴定细胞。10mg粉状MMC溶于新鲜培养液中。含不同浓度MMC的培养液于每次实验前配置。2.逆转录PCR和实时定量PCR检测XBP-1、CHOP和GRP78mRNA的转录情况。3. Western blot法检测P-PERK、PERK、P-eIF2α、eIF2α、ATF6、P-IRE1、IRE1、GRP78、CHOP、Bax、Bcl-2、Bim和Cleaved Caspase-3的表达及活化情况。4. siRNAs或慢病毒转染等基因沉默方法用于反向证明内质网应激相关蛋白CHOP、PERK、IRE1及ATF6，与MMC诱导人成纤维细胞凋亡的相关性。第三部分：1.原代培养人硬膜外瘢痕组织来源的成纤维细胞，并行免疫细胞化学法鉴定细胞。10mg粉状MMC溶于新鲜培养液中。含不同浓度MMC的培养基于每次实验前配置。2. DCFH-DA检测ROS在人成纤维细胞中的水平变化。3.脂质过氧化反应测定加入与不加入抗氧化剂MDA在人成纤维细胞中的水平变化。4. CCK-8检测加入与不加入抗氧化剂人成纤维细胞活性的变化情况。5.流式细胞术检测加入与不加入抗氧化剂人成纤维细胞凋亡的变化情况。6. Western blot法检测加入与不加入抗氧化剂人成纤维细胞内质网应激和细胞凋亡相关蛋白：GRP78、P-PERK、PERK、CHOP、Bim、CleavedCaspase-3、PARP和cleaved PARP的表达及活化情况。结果第一部分：1. MMC明显降低人成纤维细胞细胞的活性，并且呈MMC浓度和用药时间依赖性。2.流式细胞结果示MMC显著提高人成纤维细胞的凋亡率，并使细胞周期阻滞在G1期。3. TUNEL检测结果示MMC显著提高人成纤维细胞的晚期凋亡。4. MMC诱导人成纤维细胞内Cleaved Caspase-3表达水平明显增加。总PARP表达减少而PARP的剪切活化显著增加。其作用呈时间依赖性。第二部分：1.实时定量PCR示MMC显著增加人成纤维细胞内CHOP和GRP78mRNA的转录活性；逆转录PCR示MMC显著提高XBP1的剪接水平。2. MMC显著增加人成纤维细胞内质网应激相关蛋白PERK、eIF2α、ATF6、IRE1和CHOP活化及表达量，且呈浓度和时间依赖性。3.转染CHOP siRNA减少CHOP蛋白表达，显著降低MMC诱导的人成纤维细胞凋亡。凋亡相关蛋白Bim的表达水平也显著降低。同时显著增加Bcl-2的表达量。4.转染PERK shRNA减少PERK蛋白表达，显著降低MMC诱导的人成纤维细胞凋亡。同时显著下调MMC诱导增加的凋亡相关蛋白CHOP、Bim和Cleaved Caspase-3的表达水平。然而，转染IRE1和ATF6shRNA减少IRE1和ATF6蛋白表达，对MMC诱导的人成纤维细胞凋亡几乎没有作用。同样也不能降低MMC诱导增加的凋亡相关蛋白CHOP、Bim和Cleaved Caspase-3的表达水平。第三部分：1. MMC明显增加人成纤维细胞内的ROS生成。2. MMC显著升高人成纤维细胞内MDA含量，显著降低细胞活性。抗氧化剂NAC、GSH和Edaravone预处理人成纤维细胞，显著抑制MMC诱导的人成纤维细胞内MDA含量升高和细胞活性降低。3.抗氧化剂NAC、GSH、Edaravone预处理人成纤维细胞，显著抑制MMC诱导增加的人成纤维细胞凋亡。4.抗氧化剂NAC、GSH、Edaravone预处理人成纤维细胞，显著抑制MMC诱导增加的人成纤维细胞内质网应激和细胞凋亡相关蛋白GRP78、PERK、CHOP、Bim、Cleaved Caspase-3、PARP表达水平或活化。结论第一部分：1. MMC显著降低人成纤维细胞活性。2. MMC显著提高人成纤维细胞凋亡率，并阻滞细胞周期于G1期。3. MMC显著增加人成纤维细胞内凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP的剪切活化，从而导致人成纤维细胞凋亡。第二部分：1.内质网应激途径参与MMC诱导的人成纤维细胞凋亡。2.内质网应激途径的PERK通路在MMC诱导的人成纤维细胞凋亡中起关键性作用。第三部分：1. MMC通过诱导ROS的生成，进而激活内质网应激中凋亡相关蛋白，最终引起人成纤维细胞的凋亡。