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Synaptotagmin (Syt)是一类含有进化上保守的C2结构域的I型膜蛋白，主要定位于神经元细胞、内分泌细胞及其它细胞的分泌囊泡上，它们可触发和调节囊泡与细胞质膜的融合过程，参与对神经递质和激素释放的调控，也可能参与膜蛋白与膜组分的转运和更新。应用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术将Syt基因的表达进行沉默，可望帮助我们理解Syt对囊泡融合、胞吞及循环等过程的生理功能及其调节机制。本研究首先将pRNAT-H1.1-Shuttle-GFP中的绿色荧光蛋白（GFP）替换为红色荧光蛋白（RFP）以利于后继的共转研究，酶切验证及测序结果表明pRNAT-H1.1-Shuttle-RFP构建正确。转染该质粒的人胚肾（human embryonic kidney293a, HEK293a）293a细胞可在549nm激发光下产生红色荧光，表明构建后的质粒能够正常表达红色荧光蛋白。同时，我们设计并合成了Syt1及在人和大小鼠上均无沉默靶点的随机序列的shRNA片段，并将其插入到pRNAT-H1.1-Shuttle-RFP的BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点之间，构建了相应的siRNA表达载体。EcolRⅠ酶切验证及测序分析的结果表明该质粒构建正确。为提高HEK293a的转染效率及共转效率以便更精确的对siRNA的沉默效果进行评价，我们借助pIRES2-EGFP研究了人胚肾HEK293a细胞的最佳转染条件。结果表明VigoFect转染HEK293a细胞的转染效率与DNA用量、细胞密度及转染时间均存在着明显的剂量依赖性。此外，我们还借助pIRES2-EGFP及随机序列siRNA的表达载体进行了共转及先后转染HEK293a细胞的研究，结果表明在转染过程中质粒并不是等量地进入受体细胞的，进入细胞的质粒量不仅决定于转染条件，还与宿主细胞自身接纳质粒的能力有关。共转的两个质粒在同一细胞中的比例呈正比关系，表明它们在转染试剂中的分布是均匀的，这进一步表明细胞自身的接纳能力是影响质粒在不同细胞中拷贝数的重要因素。然而先后转染中两质粒的共转效率非常低，且同一细胞内的两荧光蛋白的荧光强度呈负相关，表明在前次转染中接纳质粒的细胞再一次接纳质粒的能力显著降低。为了验证Syt1siRNA表达载体对Syt1的沉默效率，我们将Syt1及其siRNA表达载体共转或先后转染HEK293a细胞，real time PCR及Western杂交的结果表明两个siRNA均能有效抑制Syt1mRNA及其蛋白的表达水平。在先后转染中，两siRNA对Syt1沉默效率的降低主要是由于两质粒较低的共转效率所导致的。