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第一部分:C57BL/6小鼠来源的脂肪间充质干细胞的分离、培养与鉴定目的:分离培养C57BL/6小鼠腹股沟脂肪组织中的脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),并鉴定其生物学特性。方法:无菌切取小鼠腹股沟皮下脂肪组织,采用0.1%I型胶原酶进行消化后用含10%FBS的低糖DMEM培养基贴壁培养小鼠ADSCs,倒置显微镜观察其细胞形态;流式细胞术检测对其表面标记物进行鉴定,行成骨及成脂诱导判断其多向分化潜能。结果:体外分离培养的小鼠ADSCs具有良好的细胞形态、较强的增殖能力,体外具有成脂、成骨分化潜能,表面标记CD29、CD44阳性,Sca-1高表达,不表达CD31。结论:利用该实验方法,能培养出高纯度、具有良好干性的小鼠ADSCs。第二部分:血管内皮生长因子C刺激的ADSCs对小鼠慢性实验性结肠炎的治疗作用及机制研究目的:研究VEGF-C刺激的ADSCs对TNBS诱导的慢性结肠炎的治疗作用并探寻其机制。方法:构建C57BL/6小鼠TNBS诱导的慢性结肠炎模型,随机分为四组:空白对照组(n=5)、TNBS模型组(n=5)、ADSCs干预组(n=5)、VEGF-C体外共孵育48h后的ADSCs的腹腔内注射组(VEGF-C+ADSCs干预组)(n=5)。在造模第1天和第21天时,分别腹腔内注射ADSCs(106细胞/小鼠)、VEGF-C+ADSCs(106细胞/小鼠),每天监测小鼠体重、结肠炎指数和疾病活动性。造模第28天处死小鼠,取结肠组织行HE染色评估结肠病理组织学、PCNA免疫组化染色评估结肠细胞增殖、TUNEL法检测结肠细胞凋亡、Alcian Blue染色检测结肠黏液分泌细胞、Masson染色检测结肠胶原纤维细胞、免疫荧光染色LYVE-1和podoplanin检测结肠组织中LVD。应用qPCR法检测各组小鼠结肠组织中炎症细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ的mRNA表达情况。应用Western Blot验证各组小鼠结肠组织中淋巴管生成因子VEGF-C及其受体VEGFR-3的表达。应用Evansblue染色进行淋巴管引流功能检测。图片分析采用Image J 1.6.0,统计分析采用GraphPad Prism 7和SPSS 25.0软件,数据均以means±SD形式表示。用单因素方差分析或者SNKq检验比较各组间差异。P<0.05表示差异有统计学意义。结果:与TNBS模型组相比,ADSCs干预组及VEGF-C+ADSCs干预组明显改善了慢性结肠炎小鼠的疾病活动性,包括体重减轻、腹泻、炎症和生存期延长(P<0.05),同时也明显改善结肠损伤评分和组织学评分(P<0.05);除体重外,VEGF-C+ADSCs干预组的效果明显优于ADSCs干预组(P<0.05)。与模型组对比,ADSCs干预组和VEGF-C+ADSCs干预组显著抑制了结肠细胞增殖(分别为51.2%±3.4%vs 35.3%±8.66%,P=0.0002;51.2%±3.4%vs 25.3%±4.3%,P<0.0001)、细胞凋亡(分别为29.2%±4.9%vs 21.2%±3.5%,P=0.0019;29.2%±4.9%vs 15.8%±2.2%,P<0.0001)和胶原纤维增生(分别为 5.6%±0.9%vs 4.6%±0.3%,P=0.0031;5.6%±0.9%vs 3.3%±0.3%,P<0.0001);同时,VEGF-C+ADSCs干预组的效果均明显强于ADSCs干预组(P<0.05)。ADSCs干预组和VEGF-C+ADSCs干预组的结肠黏液细胞均较模型组明显增多(分别为 47±10 vs 64±4,P=0.0005;47±10 vs 71±2,P<0.0001),但两干预组间未见明显差异(P>0.05)。Evans blue引流试验显示VEGF-C+ADSCs干预组的结肠淋巴管引流功能较ADSCs干预组显著增强(0.55±0.07μg vs 0.78±0.06μg,P=0.01)。免疫荧光染色显示VEGF-C+ADSCs干预组的结肠LVD较ADSCs干预组显著增加(206±15 vs 114±7,P<0.0001)。qPCR 结果显示与 ADSCs 干预组相比,VEGF-C+ADSCs 干预组 IL-6(64.30±24.06pg/ml vs 15.33±4.68pg/ml,P=0.0102)、TNF-α(45.28±6.00pg/ml vs 25.60±44.97pg/ml,P=0.0423)的 mRNA 表达均显著降低,IL-10的 mRNA 表达则显著高于 ADSCs 干预组(87.67±9.13pg/ml vs 56.08±7.93pg/ml,P<0.0001)。VEGF-C+ADSCs 干预组小鼠结肠组织中 VEGF-C 蛋白(1.39±0.09 vs 1.03±0.16,P=0.019)、VEGFR-3 蛋白(1.23±0.08 vs 0.91±0.06,P=0.0005)表达水平较ADSCs干预组显著升高。结论:在TNBS诱导的慢性小鼠结肠炎中,VEGF-C刺激后的ADSCs可以通过更明显地下调促炎细胞因子表达和提高淋巴管引流明显提高ADSCs干预后抑制肠道炎症的效果。