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目的:由于双酚A（Bisphenol A,BPA）的限制使用,双酚S（Bisphenol S,BPS）作为其主要替代物,越来越多地应用于各种工业产品和消费品。BPS普遍存在于各种环境介质中,并且可以通过皮肤接触、经口摄入或呼吸道吸入等多种方式进入到人体内。近来有研究表明,BPS暴露与睾酮缺乏以及雄性生殖功能障碍有关。睾丸内高浓度的睾酮水平对于维持生精功能和男性生育力必不可少。内源性的睾酮主要是由睾丸间质细胞产生。鉴于睾丸间质细胞在睾酮合成和精子发生中的重要作用,本研究旨在探索BPS对小鼠睾丸间质细胞（Mouse Leydig cells,TM3）的细胞毒性作用及其潜在机制,为进一步揭示BPS暴露对哺乳动物,尤其人类健康的影响提供研究基础。方法:TM3细胞在含有2.5%胎牛血清和5%马血清的DMEM/Ham’s F12培养液中,培养至对数生长期。将体外培养的TM3细胞随机分成4组,分别添加不同浓度的BPS（0、100、200、400μM）继续培养48 h后,CCK8法检测TM3细胞活力,并通过用显微镜来观察TM3细胞形态的变化;通过DCFH-DA荧光探针染色测定TM3细胞中活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的水平;可见光分光光度法检测细胞内脂质过氧化物丙二醛（Malonaldehyde,MDA）的含量、过氧化氢酶（Catalase,CAT）及超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）的活性;Calcein AM荧光探针检测线粒体通透性转换孔（Mitochondrial permeability transition pore,m PTP）的开放程度;JC-1荧光探针检测TM3细胞线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,ΔΨm）的改变;化学发光法测定细胞内ATP的生成;靶向代谢组学分析细胞的能量代谢物水平;Western blot测定自噬标志蛋白LC3B、Beclin1和P62以及凋亡相关蛋白BAX和BCL-2的表达水平;利用比色法检测TM3细胞Caspase-3的活性;透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）检测细胞中自噬体生成。结果:（1）CCK8检测结果表明,BPS浓度低于100μM对TM3细胞活力无明显影响。而相对高浓度的BPS（100、200、400、800μM）处理TM3细胞48 h后,细胞活力呈剂量依赖性下降（P＜0.05）。显微镜下可见BPS暴露显著降低了细胞密度,并且改变了细胞形态。（2）BPS暴露能够诱导TM3细胞氧化损伤。与对照组相比,BPS处理显著增加了TM3细胞内ROS和MDA的生成（P＜0.05）。同时,200μM和400μM BPS处理组细胞内的抗氧化酶CAT和SOD活性显著降低（P＜0.05）。（3）BPS处理能够诱导TM3细胞线粒体功能紊乱。JC-1荧光染色结果表明,随着BPS浓度升高,细胞线粒体膜电位（ΔΨm）逐渐降低,红色荧光与绿色荧光的比值逐渐降低（P＜0.05）,说明BPS暴露引起了ΔΨm崩塌。同时,BPS处理TM3细胞导致m PTP开放增多,表现为细胞中Calcein荧光强度明显下降。此外,BPS暴露能够显著抑制细胞内ATP的生成,并且呈剂量依赖性（P＜0.05）。（4）靶向代谢组学结果显示,与对照组相比,暴露于中剂量BPS（200μM）48 h后,TM3细胞的能量代谢发生明显改变。L-苹果酸（LMA）和一磷酸腺苷（AMP）显著上调,而焦磷酸硫胺素（TPP）、三磷酸腺苷（ATP）、β-D-果糖6-磷酸（β-D-F6-P）、顺式乌头酸、磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、环磷酸腺苷（c AMP）、D-葡萄糖6-磷酸（D-G6-P）和磷酸二羟丙酮（DHAP）显著下调（P＜0.05）。这些结果表明BPS可能影响TM3细胞的糖代谢过程。（5）BPS暴露能够诱导TM3细胞凋亡。Western blot检测发现,随着BPS浓度的增加,抗凋亡蛋白BCL-2表达显著减少,促凋亡蛋白BAX表达增加,BCL-2/BAX比值明显下降。此外,在中剂量（200μM）和高剂量（400μM）的BPS处理组,Caspase-3活性明显升高。（6）Western blot结果发现,BPS暴露能够上调自噬标志性蛋白LC3B、Beclin1和P62的表达水平,LC3B-II/LC3B-I比值明显升高。此外,TEM结果显示中高剂量的BPS处理引起细胞内大量未降解的自噬小体积累以及线粒体肿胀,说明BPS暴露能够导致TM3细胞自噬紊乱。结论:BPS暴露降低了体外培养的TM3间质细胞活力,诱导了ROS产生,破坏了线粒体功能,并进一步导致了细胞凋亡、自噬紊乱以及能量代谢的改变。因此,TM3细胞可能是BPS诱导睾丸毒性损伤的靶点之一,而线粒体氧化应激可能是BPS诱导生殖毒性损伤作用的关键机制。我们的研究结果进一步强调了BPS作为BPA替代物的潜在危害。