研究背景 结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是一种严重威胁人类健康的常见消化系统恶性肿瘤。在西方发达国家居民恶性肿瘤死因顺位中结直肠癌位居第二，在我国恶性肿瘤死因顺位中居4-6位。近二十年来我国结直肠癌发病率基本上呈现上升趋势，特别在城市以及发达农村地区，增速尤其以结肠癌更为明显。随着我国居民生活方式和饮食结构的改变，结直肠癌的危险性还会持续上升。因此结直肠癌发病机制以及防治策略的研究有十分重要意义。 从正常细胞发展到肿瘤是一个漫长而复杂的过程，涉及多阶段、多步骤、多基因作用。随着肿瘤分子生物学研究的深入，发现越来越多的基因改变参与到结直肠癌发生、发展过程，其中癌基因的活化和抑癌基因的失活是基因改变的两个重要方面，涉及遗传与表遗传的改变。遗传性改变是过去20年肿瘤分子生物学研究的基础。表遗传是一种由非DNA序列改变引起的，可遗传的基因表达水平的变化，包括DNA甲基化、组蛋白的乙酰化和染色质的构型改变浙江大学博士学位论文等。DNA甲基化是影响表遗传机制的主要因素，基因的5’端启动子和第一外显子CpG岛的甲基化与基因表达抑制、基因功能缺失有关。许多抑癌基因如pl6，ER，BRCAI，加MLHI等通过DNA异常甲基化而失活。与正常细胞相比肿瘤细胞的基因组CpG岛的甲基化状态存在差另.J。因此从研究正常组织和癌组织差异的甲基化序列出发，可以寻找新的肿瘤相关(抑癌)基因，这些基因的异常甲基化可能与肿瘤的发生、发展有关。目前DNA甲基化的研究已成为肿瘤相关基因特别是抑癌基因研究的新途径。研究目的研究结直肠癌癌旁粘膜和正常结肠组织CpG岛甲基化的分布差异，分析结直肠癌发生早期的异常CpG岛甲基化改变，探索结直肠癌发生过程中甲基化作用的(新的)肿瘤相关基因。对分离到的差异甲基化序列2F811相关墓因一staufen基因在结直肠癌病人不同组织中的表达情况进行分析。研究方法甲基化CPG岛扩增方法(MCA)富集基因组内甲基化CpG岛将基因组DNA用限制性内切酶及刀:灭活后用同裂酶火孙，习I消化，两次消化产物经酚/氛仿抽提纯化后I消化， 在T4DNA连接酶的作用下与含相同粘端的接头RXMA24/12连接，然后PCR扩增含有接头的DNA片段。代表性差异分析(RDA)筛选差异的甲基化片段将癌旁粘膜的MCA产物用曰丫万〕习I消化，切除接头，重新形成粘末端，并与新接头如JXMA24/12、第4页共97页浙江大学博十学位论文RMCA24八2等连接，以此作为检测子;用sm:I酶切除正常结肠组织的MCA产物的接头，形成平末端，以此作为驱赶子。将检测子和驱赶子按1:50一:100的比例进行杂交，用绿豆核酸酶消化单链DNA后的产物作为模板进行PCR扩增，获得差异甲基化DNA。对第1轮分析获得的甲基化差异片段再用入初习工酶切除接头，连接不同接头(有相同粘端)，进行第2轮RDA分析如此依次进行四轮RDA分析。第1一4轮分析所用的接头分别为R人ICA24/12、JxMA24/12、RMCA24/12、JXMA24八2。克隆、测序及相似性分析对第4轮RDA分析产物经克隆、测序后获得的序列，采用RePea二asker分析系统进行重复序列分析，用BLAST系统对所测的序列进行相似性分析，并通过GenBank搜索分析克隆序列与相关基因的关系。点杂交分析采用随机引物法，以地高辛标记的差异甲基化片段了A12为探针，与癌旁组织、正常组织甲基化富集后的产物和第1一4轮RDA产物杂交。半定量Rl、PCR以G3PDH的表达作为内对照，采用RT一PCR方法检测差异甲基化序列相关基因Staufen在结直肠癌癌旁粘膜、腺瘤、腺癌以及相应远端切缘正常组织中的表达情况。免疫组织化学法用免疫组织化学法检测Staufen蛋白在结直肠癌癌旁粘膜、腺瘤、腺癌以及相应远端切缘正常组织的表达情况。数据统计分析用中位数和四分位间距(P25一氏)描述mRNA水平上相对表达水平;各组间在mRNA和蛋白水平上的表达比较采用配对(比)的秩和检验(两样本Wi.eoxon和多样本F五edlnan法)。第5页共97页浙江大学博十学位论文研究结果经MCA-RDA分析，获得33个非重复序列的差异甲基化片段。通过BLAST系统相似性分析，这些片段与相关基因的关系主要分为下面4类:(l)位于相关基因的5’端或第一外显子区域，共有6个序列符合这种分布。(2)位于相关基因的内含子或其它外显子区，有16个序列属于这一类型。(3)有9个序列在Genbank中找不到相关的基因。(4)还有2个序列在基因组中找不到与之匹配的位置。差异甲基化片段IA12与GR6基因、2F8zl与Staufen、一AOz与CECR7基因位置相关。在mRNA水平上，远端切缘正常结直肠组织Staufen的表达显著高于相应的癌旁粘膜、腺瘤和腺癌(p<0.05)。从正常组织、癌旁粘膜到腺癌staufen基因的表达呈降低趋势。免疫组化结果表明，正常组织与腺癌组织的Staufen蛋白的表达水平显著高于癌旁粘膜(p<0.05)，但正常组织与腺癌组织之间未发现有统计学差别(p>0.05)。从正常结肠组织、癌旁粘膜到腺癌，staufen蛋白的表达呈现先高后低再升高的趋势，即“V’’形变化曲线。