【摘 要】
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我国是传统的养羊大国,也是目前世界上绵羊存栏数最多的国家,但大部分地方绵羊都属于季节性发情品种,这限制了绵羊的生产效率,因此从分子角度寻找与绵羊发情/繁殖相关的基因具有重要的意义。研究发现哺乳动物成功繁殖是由一系列依靠激素的行为及生理活动组成的,而这些过程又受生物钟的调控,PER基因是生物钟的核心分子,能够重启节律振荡器。目前关于PER基因在中国地方绵羊品种中的研究较少,本研究首先测定了PER基因
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我国是传统的养羊大国,也是目前世界上绵羊存栏数最多的国家,但大部分地方绵羊都属于季节性发情品种,这限制了绵羊的生产效率,因此从分子角度寻找与绵羊发情/繁殖相关的基因具有重要的意义。研究发现哺乳动物成功繁殖是由一系列依靠激素的行为及生理活动组成的,而这些过程又受生物钟的调控,PER基因是生物钟的核心分子,能够重启节律振荡器。目前关于PER基因在中国地方绵羊品种中的研究较少,本研究首先测定了PER基因在季节性发情的苏尼特羊和常年发情的小尾寒羊中不同组织的表达情况;其次对本实验前期全基因组重测序筛选获得的PER基因的SNPs在不同发情/繁殖性状的绵羊品种中进行分型验证,并把这些SNPs与有产羔记录的380只小尾寒羊进行关联分析,以确认PER基因与绵羊季节性繁殖性状的关联,为绵羊育种研究提供理论依据。最后,根据前期研究发现在miR-30a-5p的表达在季节性发情和常年发情绵羊品种中有差异,且有研究在小鼠中发现miR-30a-5p能调控PER2基因的表达,本研究进一步验证了在绵羊中miR-30a-5p与PER2基因靶标关系,以初步阐明miR-30a-5p调控绵羊季节性发情性状的分子机制。主要研究内容和结果如下:（1）PER（PER1、PER2和PER3）基因在2种不同发情性状绵羊的松果体、下丘脑、垂体、卵巢、输卵管以及子宫组织中均有表达。PER1基因的表达量在季节性发情的苏尼特羊各组织中均高于常年发情的小尾寒羊,在松果体、卵巢和输卵管中达到显著差异（P＜0.05）。分型结果表明,PER1基因的2个SNPs g.27342699G＞A和g.27346502A＞G均存在3种基因型,但只有g.27342699G＞A位点的等位基因频率在季节性发情和常年发情的绵羊品种中达到显著差异水平（P＜0.05）。关联分析结果表明PER1基因的2个SNPs与小尾寒羊第1胎、第2胎和第3胎产羔数均无无显著关联。（2）PER2基因的表达量在季节性发情的苏尼特羊卵巢和子宫组织中均显著高于常年发情小尾寒羊（P＜0.05）,而在输卵管组织中则相反（P＜0.05）;分型结果表明,PER2基因的g.2852655T＞C位点存在3种基因型,该位点的基因型频率和等位基因频率在发情性状不同的绵羊品种之间均具有显著差异（P＜0.05）,但该位点与小尾寒羊各胎产羔数无显著关联。（3）PER3基因的表达量在季节性发情的苏尼特羊各组织中（输卵管除外）均高于常年发情小尾寒羊,且在松果体和子宫中达到极显著水平（P＜0.01）;分型结果表明,PER3基因12个SNPs中,g.43657503A＞G、g.43670012T＞C、g.43670807A＞G、g.43677259T＞C和g.43707227G＞A 5个SNPs在2种不同发情状态绵羊品种之间的基因型频率、等位基因频率均达到显著差异（P＜0.05）;关联分析表明,PER3基因的12个SNPs与小尾寒羊产羔数并无显著关联,但一些少量个体的杂合突变的位点产羔数降低,大量的突变甚至有大量的纯合突变产羔数提高。（4）利用3’RACE和PCR法扩增出PER2的3’UTR和CDS区,然后运用Target Scan等生物信息学软件预测到在绵羊中miR-30a-5p与PER2基因的CDS区存在靶结合位点,3’UTR结合位点已发生突变。（5）miR-30a-5p与绵羊PER2基因的靶标关系验证:将合成的PER2基因的CDS区和3’UTR野生型和突变型的序列构建到双荧光载体中,将miR-30a-5p构建到带有绿色荧光的载体中,然后转染到293T细胞中。结果表明,与对照组相比,miR-30a-5p和PER2-CDS组荧光素酶活性显著降低（P＜0.01）,miR-30a-5p和PER2-3’UTR无明显变化。综上所述,钟基因PER（PER1、PER2和PER3）广泛表达于绵羊各个组织,且季节性发情的苏尼特羊中PER表达量在松果体、下丘脑、垂体、卵巢和子宫等繁殖相关组织均高于常年发情的小尾寒羊,说明较高水平表达的PER基因可能与季节性发情调控有关。PER2基因g.2852655T＞C位点及PER3基因g.43657503A＞G、g.43670012T＞C、g.43670807A＞G、g.43677259T＞C和g.43707227G＞A位点在季节性发情和常年发情绵羊品种之间的基因型频率、等位基因频率均达到显著差异,可能是季节性发情调控的关键位点。另外在小尾寒羊中并没有发现与其各胎产羔数显著关联的PER基因的多态性位点,说明钟基因PER可能并不能直接影响小尾寒羊产羔数。最后验证了绵羊中miR-30a-5p与PER2基因存在靶标关系。
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